2018-02-14
2104
Задача 1. У бактерий Escherichia coli было получено 5 мутантов, затрагивающих разные этапы одного и того же биосинтетического пути (схема пути приведена на рис. 4), и изучена их способность к росту на среде, содержащей соединения (I–V), являющиеся предшественниками конечного продукта VI (табл. 3).Вам необходимо определить правильную очередность синтеза соединений I-VI в рассматриваемом биосинтетическом пути, а также идентифицировать мутанты, т.е. определить этап, где произошла мутация у каждого из них.
Таблица 3
Характеристика мутантов Escherichia coli
| Мутанты | Соединения | |||||
| I | II | III | IV | V | VI | |
| 1 | - | - | - | + | - | + |
| 2 | - | + | - | + | - | + |
| 3 | - | - | - | - | - | + |
| 4 | - | + | + | + | - | + |
| 5 | + | + | + | + | - | + |
«+» – есть рост, «-» – нет роста.
Решение:
При решении задач подобного типа следует помнить, что если исследуемый ауксотрофный мутант растет на среде только в случае добавки необходимого метаболита, то у него блокирован какой-то этап биосинтетического пути на этапе, предшествующем этому метаболиту, то есть метаболит занимает в цепи место после мутационного блока. Другие более ранние предшественники, находящиеся в биосинтетическом пути перед блоком, не могут обеспечить рост мутанта. С другой стороны, если мутант накапливает определенный метаболит, то у него блокирован этап пути биосинтеза сразу же после накапливаемого метаболита. Например, в случае соединения V мы видим, что оно не обеспечивает рост ни одного из мутантов. Следовательно, в рассматриваемом биосинтетическом пути соединение V является самым первым предшественником. Затем следует соединение I, которое обеспечивает рост только одного мутанта (а именно, мутанта № 5), значит, в биосинтетическом пути оно располагается следующим. Затем следует соединение III и т.д. Следовательно, очередность синтеза соединений I-VI должна быть следующей: V®I®III®II®IV®VI.
|
|
|
Подобным образом рассуждаем и в случае идентификации мутантов. Поскольку мутант 5 не растет на соединении V, значит, мутация у него произошла на участке V®I. Мутант 4 не растет уже на двух соединениях – V и I, следовательно, мутация у него произошла на следующем участке между I®III. Мутант 2 не может расти на соединениях V, I и III, следовательно, мутация у него произошла на участке III®II. Рассуждая подобным образом и далее, определяем местоположение всех остальных мутаций.
Ответ.
Мутанты: 5 4 2 1 3
Путь: V I III II IV VI.
Такой принцип идентификации мутантов применим для любого биосинтетического пути, и является универсальным как для прокариотических, так и эукариотических организмов.
|
|
|
Задача 2. Три независимых триптофан-зависимых мутанта дрожжей, обозначенных trp B, trp D и trp E, соответственно, были ресуспендированы в физиологическом растворе и нанесены на агаризованную среду без триптофана в виде полосок, таким образом, что отдельные штрихи не соприкасались между собой, но могли использовать для своего роста метаболиты других мутантов (рис. 5). После выращивания мутантов в течение 2-3 суток был зарегистрирован рост дрожжевых клеток, как указано на рисунке. Проанализируйте результаты эксперимента и определите, какова очередность действия генов триптофанового пути у дрожжей?
|
Учитывая, что наличие роста на конкретном соединении говорит о том, что блок биосинтетического пути находится на более раннем его этапе, производим ана-
лиз картины роста мутантов дрожжей. Мы видим, что мутант trp E растет хорошо, и, следовательно, способен использовать для роста метаболиты мутантов trp D и trp B.
Значит в пути синтеза триптофана, фермент, кодируемый геном trp E, действует первым. Рост мутанта trp D слабый и неравномерный, этот говорит о том, что только один из двух мутантов обеспечивает его необходимым фактором роста. Поскольку мутант trp E имеет самый «ранний» блок триптофанового пути и не способен синтезировать метаболиты для «подпитки» других мутантов, следовательно, только клетки мутанта trp B синтезируют нужное для его роста соединение. Действительно, pост клеток мутантa trp D является более обильным в участке, приближенном к месту посева мутанта trp B. Значить фермент, кодируемый геном trp D, работает следующим.
Ответ. Последовательность генов в биосинтетическом пути:
trp E→ trp D → trp B.
Задача 3. В таблице приведены результаты теста на комплементарность для десяти точковых мутаций. «+» – комплементация мутации; «-» – отсутствие комплементации. По результатам, приведенным в таблице, определите группы комплементации.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| 1 | - | + | + | + | + | - | - | + | + | + |
| 2 | - | + | + | + | + | + | + | + | - | |
| 3 | - | - | - | + | + | - | - | + | ||
| 4 | - | - | + | + | - | - | + | |||
| 5 | - | + | + | - | - | + | ||||
| 6 | - | - | + | + | + | |||||
| 7 | - | + | + | + | ||||||
| 8 | - | - | + | |||||||
| 9 | - | + | ||||||||
| 10 | - |
Решение:
1). Анализируем первую горизонтальную строку. Мы видим, что при скрещивании первого мутанта с шестым и седьмым мутантом не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, эти мутации затрагивают одну область гена, поэтому мы можем отнести эти мутации к одной группе комплементации. При скрещивании первого мутанта со вторым, третьим, четвертым, пятым, восьмым, девятым и десятым мутантом происходит комплементации мутации (знак «+»), следовательно, эти мутации затрагивают разные области гена, поэтому мы можем отнести эти мутации к другой группе комплементации.
2). Анализируем вторую горизонтальную строку. Мы видим, что при скрещивании второго мутанта с мутантом десять не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, эти мутации затрагивают одну область гена, поэтому мы можем отнести эти мутации к одной группе комплементации.
3). Анализируем третью горизонтальную строку. Мы видим, что при скрещивании третьего мутанта с мутантами четыре, пять, восемь и девять не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, эти мутации затрагивают одну область гена, поэтому мы можем отнести эти мутации к одной группе комплементации.
Ответ: Группа 1: мутанты 1, 6, 7.
Группа 2: мутанты 2, 10.
Группа 3: мутанты 3, 4, 5, 8, 9.
Задача 4. В результате эксперимента, получено пять делеционных варианта гена Х и пять точковых мутанта этого гена. Карта делеций представлена на рис.6. Пять точковых мутанта скрестили с делеционными вариантами. Результаты скрещивания представлены в таблице.
|
|
|
| 1 | |||||
| 2 | ||||
| 3 | |||||
| 4 | |||||
| 5 | |||||
Рис.6. Делеционные варианты гена Х
| Делеция | Точковый мутант | ||||
| а | b | c | d | e | |
| 1 | - | - | - | - | - |
| 2 | - | - | + | - | - |
| 3 | - | - | + | + | - |
| 4 | + | - | + | + | - |
| 5 | + | - | + | + | + |
Решение:
Как указывалось выше, при скрещивании точкового и делеционного мутанта рекомбинанты появляются только тогда, когда делеция не затрагивает участок, в котором локализована точковая мутация. Делеции разделяют карту гена Х на пять областей (рис.6). Если при скрещивании точкового мутанта происходит рекомбинация только с некоторыми делециями, то эта точковая мутация локализована слева от самой протяженной делеции с которой произошла рекомбинация.
1. Анализируем результаты скрещивания мутанта а. Как видно из первого столбца таблицы при скрещивании точкового мутанта а с делеционными мутантами 4 и 5 происходит рекомбинация (знак «+»), а при скрещивании с делециями 1, 2 и 3.рекомбинация не происходит (знак «-»). Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 3.
2. Анализируем результаты скрещивания мутанта b. Как видно из второго столбца таблицы при скрещивании точкового мутанта b с делеционными мутантами не происходит рекомбинация не с одной делецией (знак «-»). Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 5.
3. Анализируем результаты скрещивания мутанта с. Как видно из третьего столбца таблицы при скрещивании точкового мутанта с с делеционными мутантами 2, 3, 4 и 5 происходит рекомбинация (знак «+»), а при скрещивании с делецией 1 рекомбинация не происходит (знак «-»).Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 1.
4. Анализируем результаты скрещивания мутанта d. Как видно из таблицы при скрещивании точкового мутанта d с делеционными мутантами происходит рекомбинация мутации с делециями 3, 4 и 5 (знак «+»), но не рекомбинирует с делециями 1 и 2 (знак «-»). Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 2.
|
|
|
5. Анализируем результаты скрещивания мутанта е. Как видно из таблицы мутант е рекомбинирует с делецией 5, но не рекомбинирует с делециями 1, 2, 3 и 4. Следовательно, данная точковая делеция локализована в области 4.
Ответ:
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| c | d | а | e | b |
Задача 5. В таблице представлены результаты попарных скрещиваний между пятью rII -делециями. «+» – комплементация мутации; «-» – отсутст-вие комплементации. Постройте карту делеций с указанием относительной длинны каждой из них. Какие из этих мутаций могли бы быть точковыми?
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 1 | - | - | - | - | + |
| 2 | - | - | + | + | |
| 3 | - | + | + | ||
| 4 | - | - | |||
| 5 | - |
Решение:
1). Анализируем графы таблицы для определения самой протяженной делеции. Как видно из таблицы при скрещивании первого делеционного варианта с другими делециями комплементация происходит только при скрещивании с делецией 5 (знак «+»), следовательно, делеция 1 является самой протяженной.
2). Наносим на карту делецию которая комплементирует мутацию при скрещивании с самой протяженной. Это делеция 5. Отмечаем делецию 5 справа или слева от делеции 1.
3). При скрещивании делеции 2 с делецией 1 не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, она затрагивает делецию 1, но при скрещивании делеции 2 с делецией 5 происходит комплементация мутации (знак «+»), следовательно, она не затрагивает делецию делецию 5.
4). При скрещивании делеции 3 с делециями 1 и 2 не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, она затрагивает делецию 1 и 2, но при скрещивании делеции 3 с делецией 5 происходит комплементация мутации (знак «+»), следовательно, она не затрагивает делецию делецию 5.
5). При скрещивании делеции 4 с делецией 1 и 5 не происходит комплементации мутации (знак «-»), следовательно, она затрагивает эти делеции, но при скрещивании делеции 4 с делециями 2 и 3 происходит комплементация мутации (знак «+»), следовательно, она не затрагивает делеции 2 и 3.
Ответ. Карта rII -делециями делеций:
1
2
3 5
4
Точковыми могли бы быть мутации 5, 3, 2.
Задача 6. У Pseudomonas putida получены ауксотрофные мутанты дефектные по различным этапам синтеза триптофана. Используя характеристику мутантов, приведенную в таблице, определите последовательность стадий биосинтеза триптофана у этих бактерий.
| Рост на средах с предшественником | |||||
| хоризмат | антранилат | КДРФ | индол | триптофан | |
| trpB | - | - | - | - | + |
| trpE | - | + | + | + | + |
| trpC | - | - | - | + | + |
| trpA | - | - | - | + | + |
| trpD | - | - | + | + | + |
Решение:
Если мутант не растет на минимальной среде, а способен к росту только при внесении в среду определенного предшественника синтеза триптофана, то у него блокирован этап метаболической цепи перед биосинтезом этого метаболита.
1.Мутант trpE растет при добавлении в среду любого предшественника, кроме хоризмата, следовательно, у него блокирован самый ранний этап синтеза триптофана сразу после синтеза хоризмата.
2.Мутант trpD способен расти на средах со всеми промежуточными продуктами синтеза триптофана, кроме антранилата и КДРФ. Это означает, что мутационный блок располагается сразу после синтеза антранилата, который в цепи биосинтеза находится сразу после хоризмата.
3.Мутант trpC способен использовать для своего роста триптофан, и индол, но не антраниловую кислоту и КДРФ. Следовательно, мутация trpC прерывает цепь биосинтеза сразу после КДРФ, который располагается в цепи синтеза после антраниловой кислоты, но перед индолом и триптофаном.
4. Мутант trpA растет только на среде с триптофаном и индолом. Можно заключить, что цепь биосинтеза у него блокирована на этапе между индол-3-глицерофосфатом и индолом.
5. Мутант trpВ растет только на среде с триптофаном. Можно заключить, что цепь биосинтеза у него блокирована на этапе между индолом и триптофаном.
Таким образом, последовательность метаболитов в цепи биосинтеза триптофана следующая: хоризмовая кислота → антраниловая кислота → КДРФ →индол → индол-3-глицерофосфат → триптофан.
