Каталітичні та кінетичні властивості очищеного ферменту

Реферат з курсу основи мембранології

 

тема:

Характеристика Mg²⁺ -залежної Сa²⁺-активованої ATPази

Плазматичних мембран.

Студентки І курсу

МП Біологія

Дудник Ірини

Київ

1999

ПЛАН.

Вступ. 1.Структура Mg2+,Ca2+ - ATPази плазматичних мембран;
2.Каталітичні та кінетичні властивості очищеного ферменту;
3.Регуляція ферменту внутрішньоклітинними факторами та фізіологічно-активними речовинами. Висновки.

 

Вступ: функціональна роль Ca²⁺, Mg ²⁺- ATPази плазматичних мембран.

Іони кальцію контролюють багато важливих фізіологічних функцій клітини, таких, як електрохімічне спряження при м’язевому скороченні, проникність мембран для іонів натрію та калію, впливають на роботу іонних насосів, регулюють роботу ферментів. Внутрішньоклітинна концентрація кальцію на чотири порядки нижча від зовнішньоклітинної; такий високий градієнт концентрації досягається завдяки функціонуванню АТР- залежних кальцієвих помп.

Результати досліджень енергозалежних Са²⁺-транспортуючих систем вказують на існування двох типів Са²⁺-помп: це Са²⁺ - помпи ендоплазматичного ретикулуму та плазматичних мембран. Ці системи характеризуються високою спорідненістю до Са²⁺, що відповідає концентрації цього катіона в клітині в незбудженому стані.

Для м’язів з добре розвиненим ендоплазматичним ретикулумом (серцевий, скелетні, гладенькі м’язи великих судин, подвздошної кишки) значну роль в регуляції цитоплазматичної концентрації іонів Са²⁺ може виконувати Са²⁺-помпа саме саркоплазматичного ретикулуму. Але в клітинах гладеньких м’язів ендоплазматичний ретикулум розвинений набагато гірше, ніж в скелетних та серцевих, і для більшості таких клітин величина поверхні ендоплазматичного ретикулуму складає 10 % від поверхні плазматичної мембрани. Тому є підстави вважати, що більш суттєва роль в регуляції внутрішньоклітинної концентрації іонів Са²⁺ в гладеньком’язовій клітині належить саме Са²⁺-транспортуючій системі плазматичної мембрани.

Тонічне скорочення міометрію визначається базальним потоком іонів Са²⁺, який входить в незбуджені міоцити за фізіологічних умов, і цей вхід компенсується кальцієвою помпою сарколеми.

Таким чином, Са²⁺-помпа плазматичних мембран не тільки контролює процес розслаблення гладенького м’язу, але і забезпечує довготривалий трансмембранний обмін Са²⁺, підтримуючи стаціонарне значення концентрації іонів Са²⁺ в міоцитах на рівні 10^-7- 10^-6 М, компенсуючи повільне базальне дифузійне надходження цього катіону в цитоплазму із зовнішньоклітинного простору і регулюючи міогенний тонус м‘язу.

Структура Ca²⁺, Mg²⁺ - ATPази плазматичних мембран.

Са²⁺-залежна АТР-гідролазна активність вперше була знайдена в плазматичних мембранах еритроцитів Дангемом та Глінном в 1961 році. Через 5 років було продемонстровано Шацманном, що виведення Са²⁺ з еритроцитів супроводжується процесом гідролізу АТР всередині клітини та може відбуватися проти штучно створеного високого градієнта концентрації. Але довгий час після відкриття Са²⁺, Mg²⁺- АТРази еритроцитів проблема Mg²⁺, АТР - залежного транспорту Са²⁺ залишалась мало розробленою, оскільки велись широкі дослідження іншого механізму трансмембранного переносу іонів Са²⁺,- Na⁺-Са²⁺обмінник.

Уявлення про вузьке розповсюдження Са²⁺, Mg²⁺- АТРази були спростовані лише в 1978 році, коли Ді Поло та його співробітники описали АТР-залежний транспорт Са²⁺ крізь плазматичні мембрани типових збудливих клітин - гігантських аксонів кальмара. За короткий час присутність Са²⁺, Mg²⁺- АТРази була доведена для плазматичних мембран багатьох клітин – скелетних, гладеньких м’язів та серцевих м’язів, клітин залозистих тканин, мозку та клітин. За сучасними даними Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматичних мембран відноситься до числа найбільш широко розповсюджених ферментних систем та є невід’ємним білковим компонентом плазматичної мембрани клітин еукаріот.

Перші найбільш загальні відомості про будову та функції Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран були отримані при дослідженні ферменту у складі нативної мембрани еритроцитів. Однією з найважливіших характеристик АТР-гідролазної системи є механізм гідролізу АТР. За цією ознакою всі відомі АТРази розділяють на два основних типи. АТРази першого типу (F та V-АТРази) здійснюють реакцію гідролізу АТР шляхом прямого переносу γ-фосфату молекули АТР на молекулу води. Ферменти другого типу – Р-АТРази або Е₁-Е₂-АТРази - під час гідролізу АТР утворюють проміжну фосфорильовану форму ферменту. Вони переносять γ-фосфат молекули АТР на фермент з утворенням ковалентного ацилфосфатного зв’язку з бічною карбоксильною групою амінокислотного залишку білку, а потім шляхом гідролізу цього зв’язку на молекулу води.

Дослідження функціональних властивостей Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран продемонстрували її приналежність до ферментів Е₁-Е₂ типу. При підвищенні концентрації іонів Са²⁺ в цитоплазмі відбувається зв’язування катіонів з ферментом, який знаходиться у формі Е₁-конформації, що характеризується високою спорідненістю до Са²⁺. Відбувається Са²⁺-залежний перенос γ-фосфату молекули АТР на молекулу ферменту та утворення фосфорильованого продукту Е₁-Р. На стадії фосфорильованого ферменту відбувається конформаційна перебудова білка у форму Е₂-Р. На стадії конформеру Е₂-Р спорідненість Са²⁺, Mg²⁺- АТРази до іонів Са²⁺ падає на декілька порядків. Результатом такого конформаційного переходу є вивільнення Са²⁺ у зовнішньоклітинний простір. Завершується реакційний цикл Mg²⁺-залежним дефосфорилюванням Са²⁺, Mg²⁺- АТРази та перетворенням ферменту у форму Е₁ (Рис.1).

Рисунок 1.

Схема реакційного циклу Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран.

 

                                                                 Са²⁺         

                              АТР + Е₁                                                 Е₁ - Р + АDР

                              Р_і + Е₂                                                Е₂ - Р

                                                                 Са²⁺

де Е₁, Е₂ - конформаційні форми ферменту,

Р_і - неорганічний фосфат.

Дослідження Са²⁺, Mg²⁺- АТРази у складі нативної плазматичної мембрани дозволило отримати лише найбільш загальні відомості про її структуру та функції. Для більш детального дослідження цих характеристик треба отримувати солюбілізовану форму ферменту.

Доступність солюбілізованої форми даного ферменту надала можливість визначення первинної структури молекули Са²⁺, Mg²⁺- АТРази, що дало змогу остаточного докорінного аналізу всіх його властивостей.

Вперше повна амінокислотна послідовність Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран клітин людини була встановлена в 1988 році. Для аналізу нуклеотидної послідовності було використано ген ферменту з сДНК банку тератокарциноми прямої кишки людини. Закодована послідовність складалась з 1220 амінокислотних залишків, що утворюють поліпептид молекулярною вагою 134 683 Да.

В будові ферменту були знайдені великі ділянки структурної подібності з іншими іонтранспортуючими Е₁-Е₂-АТРазами. До таких ділянок відносяться: 1) пептидна ділянка навколо амінокислотного залишку Asp-475, який фосфорилюється під час реакційного циклу; 2) FITC (АТР)- зв’язуюча ділянка; 3) пептидна ділянка, що розміщена між двома попередніми, яка забезпечує їх просторове зближення та ін. Наявність цих гомологічних та висококонсервативних ділянок в структурі Е₁-Е₂-АТРаз, напевно, обумовлено їх участю у найважливіших та загальних для всіх АТРаз етапах функціонування.

 Молекула містить 10 трансмембранних сегментів, що з’єднані на зовнішньоклітинній поверхні плазматичної мембрани досить короткими петлями. На внутрішньоклітинному боці плазматичної мембрани фермент утворює якнайменше дві довгі гідрофільні петлі (між другим та третім, четвертим та п’ятим гіфдрофобними сегментами). До складу другої петлі входять АТР-фосфорилюємий та АТР зв’язуючий сегменти каталітичного ферментативного центру. Функціональна роль першої петлі поки що не з’ясована. По аналогії з іншими Е₁-Е₂-АТРазами вона може брати участь у спряженні процесів транслокації катіонів та гідролізу АТР. Слід зазначити, що до складу цієї петлі входить також суто специфічний для Са²⁺, Mg²⁺- АТРази фрагмент, який напевно є регуляторним центром ферменту, що є чутливим до фосфоліпідів.

В середину клітини також експоновані N- та C - кінцеві ділянки Са²⁺, Mg²⁺- АТРази. Функціональна роль N-кінцевого сегменту остаточно не з’ясована, але наявність в ній великої кількості негативно заряджених амінокислотних залишків дає підстави вважати, що він бере участь у процесі безпосереднього зв’язування з іонами Са²⁺. С-кінцевий сегмент без сумніву є регуляторним, оскільки тут розташовані кальмодулінзв’язуюча аутоінгібіторна ділянка, сегмент регуляторного фосфорилювання ферменту сАМР-залежною протеїнкіназою. Області навколо кальмодулінзв’язуючої ділянки білка також багаті на від’ємно заряджені амінокислотні залишки, що дає підставу розглядати їх в якості центрів зв’язування та транслокації катіонів.  

В 1988 році була висунута гіпотеза про існування декількох ізоформ Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран при співставленні даних про первинну структуру ферменту, отриманих за допомогою методів генної інженерії та білкової хімії. Було показано, що Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматичних мембран тератокарциноми людини (hPMCA 1) відрізняється за будовою від Са²⁺, Mg²⁺- АТРази мембран еритроцитів людини. З 184 амінокислотних залишків, що входять до складу структурно охарактеризованих пептидних фрагментів Са²⁺, Mg²⁺- АТРази еритроцитів, лише 158 залишків були ідентичні відповідним амінокислотним залишкам Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран тератокарциноми.

Пызныше Шал та Гріб описали три різні ізоформи Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран з бібліотеки сДНК мозку щурів: rPMCA 1 та rPMCA 2  (rPMCA 3). Всі три ізоформи кодувались окремими генами. Одна з ізоформ Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран клітин мозку щурів (rPMCA 1) складалась з 1176 амінокислотних залишків та мала молекулярну вагу 129500 Да. Її перші 1117 амінокислотних залишків на 99 % були ідентичні трохи раніше описаній ізоформі Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран тератокарциноми прямої кишки людини (hPMCA 1). Аналіз амінокислотних послідовностей дозволив зробити висновок про те, що обидві ізоформи є продуктами одного гену, а розбіжності в структурі С-кінцевих послідовностей є результатом альтернативного сплайсингу відповідних мРНК. Аналогічно було доведено, що ізоформи hPMCA 2 тератокарциноми прямої кишки людини та rPMCA 2 клітин мозку щурів та відповідні ізоформи hPMCA 3 клітин слизової оболонки кишечнику та rPMCA 3 клітин мозку щурів також є продуктами експресії окремих структурних генів.

Слід зазначити, що при скринингу бібліотеки сДНК з мозку бика були знайдені фрагменти структурного гену ще однієї ізоформи Са²⁺, Mg²⁺- АТРази. ЇЇ структура досить істотно відрізняється від структури раніше описаних ізоформ, що є підстави говорити про існування четвертого структурного гену Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран.

За допомогою Northern blot аналізу було доведено, що експресія PMCA 1-4 генів є органозалежною: так, продукти транскрипції гену PMCA 1 характеризуються найширшою розповсюдженістю та представляють головну репрезентативну ізоформу Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран. PMCA 2 ізоформа Са²⁺, Mg²⁺- АТРази переважно виявляється в плазматичних мембранах клітин мозку, серця та печінки, PMCA 3 – в плазматичних мембранах клітин мозку та скелетних м’язів. PMCA 4 ізоформа може бути експресована в еритроцитах та інтестінальних клітинах.

Як вже було зазначено вище, первинні транскрипти кожного з генів можуть піддаватись альтернативному сплайсингу на 3’-кінці нуклеотидної послідовності. Існування великої різноманітності білкових продуктів гену PMCA 1 пояснюється виключенням, включенням або частковим включенням 3’-кінцевого екзону у нуклеотидну послідовність мРНК під час її дозрівання. Процес альтернативного сплайсингу може захоплювати ділянки РНК, які кодують функціонально важливі регуляторні центри ферменту, що знаходяться на С-кінці його поліпептидної послідовності. Зміна в структурній будові цих фрагментів є логічним поясненням існування форм Са²⁺, Mg²⁺- АТРаз, що відрізняються за чутливістю до кальмодуліну, ванадату, процесів фосфорилювання та ін.

Отже, існування різноманітних за своїми функціональними та регуляторними властивостями форм Са²⁺, Mg²⁺- АТРаз плазматичних мембран пояснюється багаточисельністю кодуючих генів Са²⁺, Mg²⁺- АТРаз та існування можливості альтернативного сплайсингу РНК матриць одного й того ж структурного гену. Однак досить логічного пояснення явищу поліморфізму для Са²⁺, Mg²⁺- АТРаз плазматичних мембран, їх тканинної специфічності, розбіжності в їх функціональних та регуляторних властивостях поки що не знайдено.

      

Каталітичні та кінетичні властивості очищеного ферменту.

 

       Са²⁺-транспортуюча АТРаза працює на підтримання концентрації іонів Са²⁺ на рівні 10^-8 – 10^-7 М. Відповідно цей фермент характеризується дуже високою спорідненістю до субстрату переносу. Очищена Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматичних мембран кардіоміоцитів мала К_0,5 по Са²⁺ у присутності кальмодуліну 0,4 мкМ, без кальмодуліну спорідненість зменшувалась: К_0,5 по Са²⁺ становила 20 мкМ. Для ферменту, отриманого з клітин інших типів (гладенькі м’язи шлунку, міометрію, клітини аорти) К_0,5 за відсутності кальмодуліну аналогічно зменшувалась більш ніж на порядок.

       На ферменті з мембран еритроцитів було виявлено, що уявна спорідненість ферменту до Са²⁺ значно збільшувалась у присутності кальмодуліну при високій концентрації Mg²⁺ і менш реагувала на кальмодулін при низькій концентрації цього катіону (менше2 мМ). Найвища уявна спорідненість до Са²⁺ спостерігалась при рН 8,0 в присутності чи у відсутності кальмодуліну і прогресивно зменшувалась при наближенні до рН 6,0.

Уявна спорідненість Са²⁺-транспортуючої АТРази мембран еритроцитів до кальмодуліну є досить високою: К_0,5 по кальмодуліну становила біля 6 нМ незалежно від концентрації Mg²⁺. К_0,5 по кальмодуліну Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран гладеньком’язових клітин шлунку складала 27,0 нМ.

Для очищеного ферменту з мембран еритроцитів показана наявність двох К_М по MgATP: високої спорідненості та низької, що дорівнювали відповідно 7 та 140 мкМ. При мілімолярних концентраціях вільного Mg²⁺, перевищуючих концентрацію АТР, активність ферменту гальмувалась.

Після перевірки в якості субстратів очищеної Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран клітин міометрію АТР, GTP, UTP, CTP, було показано, що фермент є строго специфічним відносно субстрату та гідролізує виключно молекулу АТР.

       Виявлено, що оптимум рН для Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран кардіоміоцитів 7,3, мембран еритроцитів – 7,0 – 7,25. Оптимальним для роботи очищеної Са²⁺, Mg²⁺- АТРази сарколеми міометрію є рН 7,5 – 8,0, в той час як для мембранної її форми оптимум рН знаходиться в діапазоні 6,4 – 7,0.

       Температурний оптимум для очищеної Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран еритроцитів спостерігався при 37 – 41 ^ОС, для Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран клітин міометрію – при 40 – 45 ^ОС. Підвищення температури до 50 ^ОС призводило до значного зниження активності очищеного ферменту.