Регуляція ферменту внутрішньоклітинними факторами та фізіологічно активними речовинами

Виконуючи в клітинах роль регуляторної системи концентрації іонів Са²⁺, Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматичних мембран сама є мішенню для дії великої кількості регуляторів. ЇЇ активність та спорідненість до Са²⁺ можуть значно моделюватися багатьма білковими та небілковими факторами - кальмодуліном, кислими фосфоліпідами плазматичних мембран, двохвалентними іонами, сАМР-залежною протеінкіназою та протеінкіназою С, процесом обмеженого протеолізу.

Регуляція Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран кальмодуліном. Перші відомості про регуляцію Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран кальмодуліном були отримані на початку 70-х років Бондом та Клау. В своїй роботі вченими було показано, що для переведення ферменту з менш активної форми А в більш активну форму В було необхідним додавання до виділених мембран не лише іонів Са²⁺ для моделювання реакції накопичення іонів Са²⁺, а також внутрішньоклітинного вмісту, який, напевно, містив “фактор активації”. Пізніше цей фактор було виділено, охарактеризовано та названо кальмодуліном.

Кальмодулін - це невеликий термостабільний білок, що представлений одним поліпептидним ланцюгом молекулярною вагою 16,7 кДа. Цей білок є дуже консервативним: його амінокислотна послідовність є практично повністю ідентичною в ряду від безхребетних до вищих ссавців та людини. Така еволюційна консервативність є свідоцтвом виключно важливої ролі кальмодуліна як регулятора багатьох ферментних систем живих організмів. На цей час відомо понад два десятки кальмодулінзалежних білків. Вважається, що кальмодулін є універсальним регулятором більшості Са²⁺-залежних ферментів, але лише для Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран показана пряма регуляція кальмодуліном її активності через безпосередню взаємодію ферменту та активатора. Взаємодія Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран з кальмодуліном призводить до підвищення спорідненості системи до іонів Са²⁺ (у присутності кальмодуліна К_0,5 для Са²⁺ = 0,5 мкМ, у відсутності - К_М для Са²⁺ = 10 - 20 мкМ) та 10-кратного підвищення швидкості гідролізу АТР та трансмембранного перенесення Са²⁺. Кальмодулінзв’язуючий сегмент Са²⁺, Mg²⁺- АТРази характеризується: 1) наявністю великої кількості позитивно заряджених залишків Arg та Lys та їх переважною локалізацією на N-кінцевій ділянці сегмента; 2) переважанням гідрофобних залишків на С-кінцевій ділянці сегмента; 3) наявністю залишку Trp та трьох залишків Ser відповідно на N- та С-кінцевих ділянках пептида. Сам кальмодулінзв’язуючий сегмент знаходиться, як вже було зазначено вище, в С-кінцевій області ферменту.

Виходячи з подібних досліджень, було запропоновано можливий механізм взаємодії Са²⁺, Mg²⁺- АТРази з кальмодуліном: N-кінцевий сегмент кальмодулінзв’язуючого домену, збагачений залишками Arg та Lys, за відсутності кальмодуліна взаємодіє з високоафінним Са²⁺-зв’язуючим доменом, частково інактивуючи фермент. При додаванні кальмодуліна, активатор взаємодіє з кальмодулінзв’язуючим центром Са²⁺, Mg²⁺- АТРази,    руйнуючи попередню взаємодію та вивільнюючи Са²⁺-зв’язуючий домен ферменту.

Регуляторний вплив на Са²⁺, Mg²⁺- АТРазу кислих фосфоліпідів плазматичних мембран. Регуляторна дія кислих фосфоліпідів на активність Са²⁺, Mg²⁺-АТРази досліджувалась на препаратах виділеного та очищеного ферменту. До очищеної Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран додавались такі негативно заряджені фосфоліпіди: фосфатидилінозитол 4,5-бісфосфат (PtdIns4,5P₂), фосфатидилінозитол 4-фосфат (PtdIns4P), фосфатидилінозитол (PtdIns), фосфатидилсерін (PtdSer) та фосфатидна кислота (PtdOH). Відносна ефективність впливу перелічених фосфоліпідів на активність солюбілізованої Са²⁺, Mg²⁺- АТРази розподілилась за таким рядом: PtdIns4,5P₂> PtdIns4P > PtdIns = PtdSer = PtdOH [44]. Стимулюючий ефект кислих фосфоліпідів кінетично проявляється в майже 10-кратному підвищенні швидкості реакції (V_max) транспортування катіонів та гідролізу АТР та спорідненості ферменту до іонів Са²⁺. Але регуляторний вплив кислих фосфоліпідів на Са²⁺, Mg²⁺- АТРазу є більш складним, оскільки дуже високі їх концентрації призводять до відчутного зниження V_max. Також було підтверджено експериментально, що регуляторна дія кислих фосфоліпідів проявляється як в присутності, так і у відсутності кальмодуліна. Це дозволило зробити висновок про незалежність механізмів дії кальмодуліна та кислих фосфоліпідів на Са²⁺, Mg²⁺- АТРазу та відокремленість їх регуляторних центрів в молекулі білка.

Вплив сАМР-залежної протеїнкінази та протеїнкіназои Сна активність Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран. сАМР-залежний сайт фосфорилювання Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран еритроцитів знаходиться на С-кінці поліпептидного ланцюга збагаченого залишками серіну. Процес фосфорилювання сАМР-залежною протеїнкіназою Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран призводить до підвищення її активності: К_0,5 для іонів Са²⁺ падає з 10 мкМ до 1,4 мкМ, а V_max процесу гідролізу АТР зростає приблизно в 2 рази. На відміну від кальмодулін незалежного впливу кислих фосфоліпідів на активність Са²⁺, Mg²⁺- АТРази процес фосфорилювання ферменту сАМР-залежною протеїнкіназою чутливий до присутності кальмодуліна: кальмодулін запобігає процесу фосфорилювання та стимуляції Са²⁺, Mg²⁺- АТРази сАМР-залежною протеїнкіназою.

Фосфорилювання Са²⁺, Mg²⁺- АТРази плазматичних мембран протеїнкіназою С також підвищує V_max каталізуємої ферментом реакції та його спорідненість до іонів Са²⁺. Але на відміну від сАМР-залежної протеїнкінази вплив протеїнкінази С та кальмодуліна є аддитивними.

Є дані про чутливість активності Са²⁺, Mg²⁺- АТРази фракції сарколеми гладеньм’язових клітин до фізіологічно активних та фармакологічних речовин – окситоцина, брадикініна, простагландинів, естрогенів та прогестерона, карбахола, сигетина.

Окситоцин – це пептидний гормон, що складається з 9 амінокислотних залишків, синтезується в супраоптичних та паравентрикулярних ядрах гіпоталамусу та депонується в нейрогіпофізі. Окситоцин стимулює скорочення м’язових клітин матки та міоепітеліальних клітин молочних залоз. Під впливом цього гормону зростає амплітуда та частота скорочень клітин міометрію, підвищується тонус матки. Окситоцинові рецептори розміщені на поверхні плазматичних мембран клітин-мішеней. На жаль молекулярний механізм дії даного гормону поки що остаточно не з’ясований.

Дослідженнями, проведеними на фракції плазматичних мембран клітин міометрію було продемонстровано, що окситоцин інгібує активність мембранозв’язаної Са²⁺, Mg²⁺- АТРази- введення окситоцину в середовище гомогенізації тканини міометрію призводить до зниження рівня АТР-залежної акумуляції іонів Са²⁺ в везикулах сарколеми, причому, інгібіторний вплив окситоцину на активність Са²⁺, Mg²⁺- АТРази проявлявся в присутності гормону саме всередині везикул сарколеми, тобто він опосередкований взаємодією гормону із специфічними рецепторами на зовнішньоклітинному боці плазматичної мембрани. Дослідження інгібіторного впливу окситоцину на мембранозв’язаний та очищений фермент за. різних концнтрацій гормону дає можливість передбачати, що окситоцин впливає на Са²⁺, Mg²⁺- АТРазу плазматичних мембран опосередковано через певні мембранні структури, наприклад гліколіпіди.

Простагландини, гормоноподібні регуляторні молекули, похідні арахідонової та інших поліненасичених жирних кислот, досить широко використовуються в медичній практиці. Механізм дії простагландинів, що призводить до стимуляції скорочень міометрію майже не досліджений, але існує думка, що однією з причин стимуляції скоротливої активності міометрію під впливом цих сполук може бути підвищення концентрації внутрішньоклітинного Са²⁺ внаслідок інгібування простагландинами Са²⁺-помпи плазматичної мембрани. Показано, що простагландин Е₂ та простагландин F_2a інгібують Са² На препараті солюбілізованого та очищеного ферменту простагландини Е₂ та F_2a в діапазоні концентрацій ⁺, Mg²⁺- АТРазну активність препарату плазматичних мембран міометрію. 10^-8 – 10^-4 М абсолютно не впливають на його активність. Такі дані очевидно пояснюються тим, що простагландини впливають на активність Са²⁺- транспортної АТРази плазматичних мембран не безпосередньо, а через рецептор та системи, що забезпечують спряження останнього з ферментом.

ВИСНОВКИ

Са²⁺-помпа плазматичних мембран виконує дві основних функції: контролює процес розслаблення гладенького м’язу та забезпечує довготривалий трансмембранний обмін Са²⁺, підтримуючи стаціонарне значення концентрації іонів Са²⁺ в міоцитах на рівні 10^-7- 10^-6 М, компенсуючи повільне базальне дифузійне надходження цього катіону в цитоплазму із зовнішньоклітинного простору і регулюючи міогенний тонус м‘язу.

Са²⁺-помпа плазматичної мембрани активується кальмодуліном і таким шляхом може брати участь в кальцієвій регуляції циклу скорочення-розслаблення гладеньком’язової клітини. Крім того, активність Са²⁺-помпи плазматичних мембран гладеньких м’язів (судин, матки) чутлива до змін мембранного потенціалу, кислих фосфоліпідів, фософрилювання протеїнкіназою С. Спорідненість Са²⁺, Mg²⁺- АТРази до іонів Са²⁺ набагато вища за спорідненість інших Са²⁺-трaнспортуючих систем – Na⁺ - Cа²⁺ обмінника та Cа²⁺ транспортної системи мітохондрій. Так, на міометрії показано, що К_0,5 по Са²⁺ дорівнює для вищезгаданих систем 0,49, 50-60 та 4,07 мкМ відповідно. Крім того, Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматичних мембран гладеньком’язових клітин чутлива до дії деяких фізіологічних та фармакологічних речовин, регуляторів скорочення-розслаблення міоцитів. Інгібування Са²⁺-помпи плазматичної мембрани гладеньких м’зів окситоцином, простагландинами, сигетином та іншими речовинами, що активують скорочення гладеньких м’язів свідчить про участь цієї системи в контролі процесу розслаблення цих м’язів.

Список використаної літератури:

1. Костерин С.А. Транспорт кальция в гладких мышцах. – К.: Наукова думка, 1990. – 216с.

2. Костерин С.А., Червоненко И.В., Бурдыга Ф.В. Механизм кальциевого контроля тонического сокращения гладкой мышцы // Биофизика. – 1990. – Т. 35, № 4. – С. 665 – 669.

3. Зварич Е.И. Са²⁺, Mg²⁺- АТРаза плазматических мембран. Структура и функции // Биологические мембраны. – 1991. - Т. 8, № 6. - С. 565 - 585.

4. Любаковская Л.А., Слинченко Н.Н., Бурчинская Н.Ф., Курский М.Д. Каталитические свойства очищеной Са²⁺, Mg²⁺- АТРазы сарколемы миометрия // Биохимия. – 1990. - Т. 55, № 7 - С. 1237 – 1243.

5. Carafoli E. The Ca²⁺ pump of the plasma membrane // J. Biol. Chem. – 1992. – Vol. 267, № 4. – P. 2115 – 2118.

6. Raeymaekers L., Wuytack F. Ca²⁺ pumps in smooth muscle cells. // Journal of Muscle Research and Cell Motility. 1993, V.14, № 1. - P. 141 – 157.