Объясните, что означает термин «компетентные клетки»; кратко опишите способ их получения

Из терминологии Глика… Компетенция (Competence) - Способность бактериальных клеток воспринимать трансформирующую ДНК (обычно плазмиду).

Я только что понял, что прошлый раз на рубежке написал всякую сложную дичь из того практикума со всякими растворами и буферами…. А можно было так:

Компетентностью при генетической трансформации обычно называется способность бактериальных клеток адсорбировать и поглощать чужеродную ДНК.

У многих видов бактерий компетентность возникает лишь на определенном этапе роста культуры.

Например, культуры стафилококков находятся в стадии компетентности в ранней логарифмической фазе роста.

Культуры бактерий Bacillus subtilis находятся в стадии компетентности на более поздних этапах экспоненциального роста,

Гемофильные бактерии – в стационарной фазе роста.

У некоторых бактерий клетки компетентны в любой фазе роста (например, у гонококков и менингококков).

Компетентные клетки у различных видов бактерий отличаются от некомпетентных не только способностью к поглощению ДНК, но и другими свойствами:

• обладают сниженным уровнем метаболизма;
• более устойчивы к пенициллину, чем остальные клетки в популяции;
• сниженным темпом репликации ДНК или вообще ее отсутствием;
• меньшими размерами, чем некомпетентные;
• изменением наружных слоев, наличием обнаженных участков цитоплазматической мембраны;
• повышенной чувствительностью к осмотическому шоку, тепловой
обработке;
• сниженным поверхностным зарядом.

Однако существует много видов бактерий, у которых отсутствует естественная компетентность. Примером таких бактерий являются E. coli, бактерии рода Erwinia и другие, но несмотря на это, они также могут быть трансформированы в компетентные.

Химические методы

● Клетки Е. соli не обладают природной компетентностью. Однако ввиду важности этого организма для молекулярной генетики, были разработаны методы, позволяющие придавать им искусственную компетентность, выращивая клетки в специальных минимальных питательных средах, содержащих глюкозу в качестве источника углерода. Наибольшую известность приобрел метод индукции компетентности с помощью ионов кальция – кальциевый метод.

Клетки бактерий выдерживают в присутствии ионов Са2+ (50 мМ) при 0 ºС с последующим кратковременным тепловым воздействием при 37 ºС или 42 ºС. Эффективность трансформации повышается при совместном действии ионов Са2+ с ионами Mg2+, Mn2+ или Rb+. Кроме того, эффективность трансформации повышается при увеличении времени инкубирования с ионами Ca2+, а также при добавлении диметилсульфоксида. Ионы Mg2+ необходимы для активации специфических нуклеаз, участвующих в захвате экзогенной ДНК.

Физические методы:

● Широко используется также способ индукции компетентности за
счет глубокого замораживания с последующим оттаиванием клеток. При этом осуществляется трансформация как хромосомной, так и плазмидной ДНК. Такой способ трансформации получил название криотрансформации. Чтобы получить трансформанты с помощью этого метода, смесь реципиентных клеток и ДНК донора в присутствии криопротектора
(0,5 % раствора твина-80) замораживают (до –196 ºС), а затем отогревают при +42 ºС и высевают на селективные среды, позволяющие отобрать трансформанты.

● В последнее время трансформацию успешно осуществляют с помощью электропорации. Существуют специальные приборы – электропораторы, которые за счет кратковременного воздействия (обычно 5–20 мс) электрического поля высокой напряженности (1–15 кВ/см) на клеточную мембрану приводят к образованию в ней пор (электропробой).
Время существования и размер пор достаточны, чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней среды войти в клетку в результате действия осмотических сил. Объем клетки при этом увеличивается. Напряженность электрического поля и продолжительность его действия,
концентрации трансформирующей ДНК и клеток-реципиентов для каждой системы клеток подбирают экспериментально.

8. Опишите метод создания и скрининга геномных библиотек; объясните, для каких целей используется.

Геномная библиотека представляет собой набор ДНК всего генома одного организма. Эта ДНК хранится в популяции идентичных векторов, каждый из которых содержит различные вставки ДНК.

Для построения геномной библиотеки ДНК экстрагируют из клеток и затем расщепляют рестриктазой, чтобы разрезать ДНК на фрагменты определённого размера. Фрагменты затем встраивают в вектор с помощью фермента ДНК-лигазы. Далее вектор ДНК может быть встроен в организм-хозяин — обычно в популяцию кишечной палочки (E. coli) или дрожжей, где в каждой клетке содержатся копии вектора с одной, уникальной вставкой.