Изучение биологически активных соединений – ферментов и антибиотиков. Создание новых методов

 

В 20‑40‑х годах была установлена структура, исследована биологическая активность и проведены синтезы важнейших гормонов (Л. Ружичка и А. Бутенандт, Нобелевская премия, 1939), стероидов и желчных кислот (А. Виндаус, Нобелевская премия, 1928; Г. Виланд, Нобелевская премия, 1927), витаминов и коферментов (А. Виндаус, П. Каррер, Р. Кун, П. Стинбок, А. Сцент‑Дьёрдьи). Конец 40‑х годов ознаменовался открытием антибиотиков – пенициллина (А. Флеминг, Г. Флори и Э. Чейн, Нобелевская премия, 1945) и стрептомицина (3. Ваксман, Нобелевская премия, 1952) и созданием антибиотической промышленности (см. главу 7).

Наиболее важными и тесно связанными с изучением обмена веществ были исследования ферментов как индивидуальных химических соединений. Существовавшие до 20‑х годов XX в. сомнения относительно их белковой природы были рассеяны после разработки американским биохимиком Дж. Самнером (1926) метода кристаллизации ферментов и получения кристаллической уреазы. В следующем десятилетии было получено большое число кристаллических ферментов (Дж. Самнер, Дж. Нортроп и У. Стенли – Нобелевская премия, 1946) и все они оказались белками. Новый метод получения чистых препаратов ферментов значительно ускорил исследования кинетики ферментативных реакций и свойств отдельных ферментов.

В 40‑е годы начинают интенсивно разрабатываться новые методы исследований, в первую очередь физико‑химические. Они знаменовали начало радикальных изменений в осуществлении исследовательского поиска и создание новой экспериментальной техники. Возможность использования автоматического и полуавтоматического лабораторного оборудования, созданного в 50‑х годах с использованием принципов, разработанных в предвоенные годы, вызвала бурный рост биологической химии, который она переживает в настоящее время.

В 20‑х годах Т. Сведбергом (Нобелевская премия, 1926) были построены первые аналитические ультрацентрифуги с масляными роторами, представлявшие собой гигантские сооружения. С их помощью были получены первые сведения о форме и размерах белковых молекул. В 30‑е годы А. Тизелиус (Нобелевская премия, 1948) разработал метод электрофореза в свободной фазе, блестяще примененный Г. Теореллем (Нобелевская премия, 1955) для исследования природы взаимодействия кофермента и апофермента. В 1940 г. А. Мартин и Р. Синг (Нобелевская премия, 1952), использовав идею, высказанную в 1913 г. русским физиологом М.С. Цветом, разработали метод хроматографии на бумаге. Этот принцип, введенный впоследствии и в электрофоретические исследования, произвел настоящую революцию в аналитической биохимии.

 

 

Биоэнергетика.

 

Понятие «биоэнергетика» ввел в науку А. Сцент‑Дьёрдьи, выпустивший в 1957 г. монографию под тем же названием. Термин «биоэнергетика» признан наилучшим 11 лет спустя группой ведущих специалистов по биохимии дыхания и фотосинтеза, собравшихся в Полиньяно (Италия), чтобы определить новую область биологии, связанную с изучением молекулярных механизмов энергетического обмена клетки.

Проникновение на молекулярный уровень организации обличает биоэнергетиков от физиологов и биохимиков, изучавших внешние суммарные показатели и спецификацию химических реакций энергетического обмена организма. Биоэнергетика ставит перед собой два вопроса: какие именно молекулы среди всего разнообразия природных соединений ответственны за превращение энергии в клетке, и каким образом они выполняют свою функцию.

Первая из упомянутых проблем уже решена применительно к большинству биологических процессов трансформации энергии. Начало этому направлению было положено в середине 40‑х годов, когда В.А. Энгельгардт и М.Н. Любимова обнаружили АТФазную активность нерастворимого мышечного белка миозина. Авторы сделали вывод о том, что именно миозин ответствен за трансформацию химической энергии АТФ в механическую работу мышц. Впоследствии эта мысль получила полное подтверждение в работах многих исследователей, показавших, что гидролиз АТФ вызывает конформационное изменение актомиозинового комплекса, что в свою очередь вызывает сокращение мышечного волокна. В дальнейшем выяснилось, что и многие другие типы трансформации энергии в клетке осуществляются посредством нерастворимых белковых комплексов, которые обычно встроены в те или иные мембранные образования.

Последнее обстоятельство определяет тесную взаимосвязь и взаимопроникновение биоэнергетики и биологии мембран как новой отрасли современной биологии.

В 1949 г. А. Ленинджер в США показал, что важнейший процесс аккумуляции энергии – окислительное фосфорилирование, открытое в 1930 г. В.А. Энгельгардтом, – локализован в митохондриях, имеющих две мембраны – внешнюю и внутреннюю. В начале 60‑х годов выяснилось, что внутренняя мембрана митохондрий служит носителем ферментов окислительного фосфорилирования. Вслед за этим было показано, что фотофосфорилирование, обнаруженное в середине 50‑х годов Д. Арноном (США), также локализовано в структурных мембранах, а именно в тилакоидах хлоропластов. Мембранная локализация ферментов окислительного фосфорилирования и фотофосфорилирования оказалась характерной для микроорганизмов.

Роль мембран в окислительном фосфорилировании представлялась неясной в рамках традиционных «химических» гипотез энергетического сопряжения, постулировавших, что процессы переноса электронов и образования АТФ связаны между собой через промежуточный продукт неизвестной химической природы. Подобные взгляды развивались в 40‑е годы Ф. Липманом (Нобелевская премия, 1953), а затем Э. Слейтером и Б. Чансом (США) и др.

Дальнейший прогресс в разработке проблемы окислительного фосфорилирования связан с именем английского биохимика П. Митчела, разработавшего в 1961–1966 гг. так называемую хемиосмотическую теорию окислительного фосфорилирования. По Митчелу, химическая энергия процесса окисления в митохондриях превращается сначала в электрическую (мембранный потенциал), а затем вновь переходит в химическую форму и используется для фосфорилирования АТФ неорганическим фосфатом. В самые последние годы эта гипотеза была подтверждена работами советских и американских лабораторий. Оказалось, что цепь окислительных ферментов – переносчиков электронов располагается поперек внутренней мембраны митохондрий, в результате чего окислительная реакция приводит к переносу электронов от одной стороны мембраны к другой ее стороне и к появлению разности электрических потенциалов между вне‑ и внутримитохондриальными участками. Мембранный потенциал может быть образован также за счет гидролиза АТФ митохондриальной АТФазой, локализованной во внутренней мембране. Этот процесс обратим, что обеспечивает возможность использования энергии окисления, превращенной в мембранный потенциал, для синтеза АТФ.

В 1971 г. Э. Ракеру (США) удалось продемонстрировать самосборку мембранных пузырьков, способных к окислительному фосфорилированию. Пузырьки, образованные из фосфолипидов и очищенных ферментов дыхания и фосфорилирования, генерировали мембранный потенциал и синтезировали АТФ за счет энергии, освобождающейся при окислении аскорбиновой кислоты кислородом.

Изучение функций мембранного потенциала в митохондриях привело к выяснению природы осмотической работы целого ряда биомембран. Оказалось, что катионы, проникающие через мембрану митохондрий, накапливаются внутри этих органелл под действием электрического поля, которое генерируется дыханием или расщеплением АТФ. Обнаружилось также, что проникающие слабые кислоты аккумулируются митохондриями, двигаясь по градиенту pH, возникающему в результате работы тех же ферментативных систем, которые образуют мембранный потенциал.

Выяснение природы движущих сил ионного транспорта в митохондриях позволило продвинуться в понимании механизма осмотической работы мембраны хлоропластов и бактерий. Оказалось, что и в этих случаях химическая энергия субстратов окисления или АТФ, а также энергия света сначала превращается в электрическую и лишь затем используется для переноса целого ряда соединений против концентрационных градиентов.

Иной механизм обнаружился при изучении осмотической работы клеточной мембраны животных организмов. Оказалось, что в этом случае первичным процессом является, как правило, выход из клетки ионов Na⁺ в обмен на внешние ионы K⁺. Источником энергии служит гидролиз АТФ, который катализируется специальным мембранным ферментом – АТФазой, активизируемой ионами Na⁺ и К⁺ (Na, К‑АТФазой). Перенос веществ в клетку против концентрационных градиентов происходит вместе с ионами Na⁺, которые движутся внутрь клетки по градиенту своей концентрации. Механизм этого явления, как и строение Na, К‑АТФазы, остаются неясными.

Подобное положение характерно также для многих других явлений трансформации энергии в клетке, таких, как механическая работа актомиозина, сократительных белков сперматозоидов, бактерий и фагов, механическая работа рибосом, энергообеспечение процесса нервного возбуждения и т. д. Во всех этих случаях выяснена природа ферментов (или комплексов ферментов с небелковыми компонентами), осуществляющих акт трансформации энергии, но каким образом происходит этот акт, пока остается неизвестным. Сказанное относится даже к такому сравнительно простому случаю, как рассеяние энергии дыхания в виде тепла. Доказано, что этот процесс у теплокровных животных может оказываться биологически полезным в условиях внешнего охлаждения организма. Однако в цепи событий, происходящих между дыханием и повышенной продукцией тепла на холоду, еще остаются неясные моменты. Выяснение механизма действия ферментных систем – трансформаторов энергии является важнейшей задачей биоэнергетики на данном этапе ее развития.

 

 

* * *

 

Расцвет биологической химии после первой мировой войны выдвинул ее в число наиболее быстро развивающихся и перспективных, областей знания.

К концу 50‑х годов биологическая химия приобрела черты сложной комплексной науки, выводы которой имеют первостепенное значение для обширного круга вопросов. Для изучения закономерностей биохимических процессов и проникновения в сущность жизненных явлений биохимики используют достижения физики, общей, органической и физической химии, фармакологии, патофизиологии и других отраслей медицины, развитие которых теперь в свою очередь зависит от успехов биологической химии.

В рамках этой дисциплины началась дифференциация. Уточнение данных о деталях превращений химических веществ и о различиях в химическом составе организмов привели к возникновению сравнительной и эволюционной биохимии (см. главу 21). Биохимия изучает также важнейшие формы организации материи – пограничную область между живой и неживой природой. В 1924 г. А.И. Опарин выдвинул теорию возникновения жизни на Земле, заложив основы нового направления биохимии (см. главу 22).

Данные биохимии широко Используются в сельском хозяйстве и медицине. Успехи в изучении последовательности процессов основного обмена веществ, прежде всего у микроорганизмов, позволили начиная с 40‑х годов приступить к созданию микробиологической промышленности и выпуску антибиотиков, витаминов, органических кислот и аминокислот, некоторых органических полупродуктов и, наконец, кормовых белков (см. главу 7).

Всем этим были заложены основы перехода биологической химии на новый, современный этап, характеризующийся комплексным подходом к изучению процессов, протекающих в организме, в первую очередь био‑, синтетических и энергетический, и дальнейшим внедрением в эту науку, методов и представлений физики и физической химии. Развитие исследований по биологической химии, осуществляемых на молекулярном уровне, рассмотрено в главе 23.

 

 

Глава 7

Общая микробиология