Методы выделения энтеровирусов в культурах клеток

Исследование полученных элюатов на энтеровирусы проводят в культуре ткани в соответствии с документом «Руководство по вирусологическим исследованиям полиомиелита», рекомендованным Всемирной организацией здравоохранения (1998). При этом следует отметить, что для выделения вирусов используют максимально возможный полученный элюат (кроме 1 мл, заложенного на хранение, и объема, используемого для исследования в ИФА и ПЦР). Для выделения вирусов используют следующие культуры тканей: RD, Hep-2, BGM и другие чувствительные к энтеровирусам линии клеток.

Перевиваемые культуры клеток RD, Hep-2 (Cincinnatti), BGM наиболее пригодны для проведения лабораторных исследований и позволяют выделять достаточно широкий спектр энтеровирусов, которые могут присутствовать в водных объектах окружающей среды.

Культура клеток RD, происходящая из человеческой рабдомиосаркомы, обладает высокой чувствительностью к вирусам полиомиелита, многим типам вируса ECHO, некоторым вирусам Коксаки А. Вирусы полиомиелита и вирусы Коксаки В хорошо размножаются в культуре клеток Нер-2, полученной из эпидермоидной карциномы человека. Культура клеток BGM - перевиваемая культура клеток почек африканской зелёной мартышки, чувствительна к вирусам полиомиелита и вирусам Коксаки В. Использование, по крайней мере, двух культур позволяет выявлять, возможно, больший спектр вирусов, а комбинация клеток, обладающих различной чувствительностью к различным энтеровирусам, может помочь при идентификации выделенного цитопатогенного агента. Чрезвычайно полезным является поддержание и использование в лабораторных исследованиях культуры клеток L20B. Эта культура клеток создана на основе мышиной линии L-клеток, в которую экспрессированы человеческие рецепторы к полиовирусу. Она позволяет селективно выделять только полиовирусы, что делает её незаменимой культурой при идентификации выделенных цитопатогенных агентов для разделения смесей вирусов. Чувствительность культур клеток к различным энтеровирусам представлена в табл. 2.

Таблица 2

Чувствительность перевиваемых культур клеток к различным энтеровирусам

Культуры клеток для лабораторного исследования следует получать из аттестованного источника, например, из лаборатории, обладающей банком клеток. Необходимо периодически контролировать чувствительность используемых в лаборатории клеток. Для этого после каждых 8-10 пассажей клеток на них проводят титрование референс-штаммов вакцинного вируса полиомиелита. После 15-20 последовательных пассажей следует перейти на свежую линию из банка клеточных культур или получить её в референс-лаборатории. Эта процедура позволяет сохранять высокую чувствительность клеток и снижает риск контаминации клеток микоплазмами.

Для исследования одной пробы используют не менее двух культур клеток площадью не менее 75 см². Это соответствует трём флаконам ёмкостью 50,0 мл (поверхность каждого флакона составляет 25 см²). Два из этих флаконов должны быть с культурой клеток RD, один - с любой другой из рекомендованных культур. Флаконы со свежеобразованным монослоем клеток микроскопируют для того, чтобы убедиться в здоровом состоянии клеток. Монослой клеток, подходящий для заражения, обычно формируется в течение 2-3 дней после «посадки» клеток на флаконы при концентрации клеток 1×10⁶ мл ростовой среды. После замены ростовой среды на 4,5 мл поддерживающей среды (без сыворотки) флаконы маркируют (указывают номер пробы, дату заражения, номер пассажа). В каждый флакон вносят по 0,5 мл обработанной исследуемой пробы воды. Все используемые клеточные линии следует инокулировать одновременно. Обязательно оставляют по 1 незаражённому контрольному флакону каждой культуры. Флаконы инкубируют в термостате при температуре 36 °С. Ежедневно, обычно в течение 5-7 дней, проверяют культуры на наличие цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Все признаки ЦПЭ, токсичности, контаминации посторонними микроорганизмами регистрируют в лабораторном журнале. При появлении ЦПЭ (при охвате изменениями 75 % клеточного монослоя) прекращают инкубацию флаконов и сохраняют культуральную жидкость при 20 °С для следующего пассажа на той же культуре клеток. Содержимое каждого флакона с культурой клеток пассируют индивидуально, флаконы никогда не объединяют. Для пассажа могут быть использованы культуры, выращенные в пробирках. Если при первичном заражении не наблюдали ЦПЭ, то делают так называемый «слепой» пассаж. Культуры, в которых не проявлялся ЦПЭ, инкубируют и наблюдают в течение не менее 14 дней. При отсутствии ЦПЭ в течение этого срока культуры отбрасывают как негативные.

При хорошем состоянии культуры клеток первичное заражение и один пассаж вместе составляют период наблюдения 14 дней. В ряде случаев (например, при выделении агента с низкой цитопатогенной активностью, или при наличии в пробе вируса в небольшом количестве) необходимо сделать последующие пассажи. При этом следует помнить, что каждый последующий пассаж увеличивает риск перекрестной контаминации.

При выделении вирусов из проб воды различного происхождения в культуре клеток можно столкнуться с рядом нежелательных явлений. Если при первичном заражении в культуре клеток развивается быстрая (в течение 1-2 дней после внесения исследуемого субстрата) дегенерация клеток, то, скорее всего, это связано с неспецифической токсичностью пробы. Такие культуры нужно заморозить при -20 °С, оттаять и выполнить пассаж. Если признаки токсичности обнаружатся вновь, то следует вернуться к исходной пробе, развести её ФСБ 1:10 и повторить заражение. Бактериальная контаминация, которая проявляется в виде помутнения среды, приводит к гибели клеток и делает выявление вирусного ЦПЭ затруднительным или невозможным. В этом случае следует вернуться к исходной пробе, обработать её хлороформом и повторить процедуры заражения.

Особое внимание следует уделять предупреждению перекрёстной вирусной контаминации во время процедур заражения и пассирования. Нельзя сливать среду через край флакона или пробирки, в которые вносилась исследуемая проба, даже если ЦПЭ отсутствует. Удаление среды производят пипеткой, которую меняют после каждой процедуры. При заражении с помощью автоматических микропипеток используют только наконечники с фильтрами. Следует избегать процедур, при которых образуются аэрозоли (например, энергичное пипетирование); по возможности не рекомендуется использование посуды с резиновыми пробками, которые помещаются внутрь горлышка флакона или пробирки, целесообразно использовать посуду с внешней резьбой на горлышке, которая закрывается завинчивающимися крышками.

Известно, что в пробах воды присутствуют смеси вирусов, с чем могут быть связаны затруднения при идентификации выделенных изолятов. Для разделения смесей и правильной идентификации выделенных вирусов, а также для того, чтобы избежать потери вирусов полиомиелита, все изоляты, «положительные» на культуре клеток RD, следует пассировать на клетки L20B. Наличие выраженного ЦПЭ указывает на присутствие в пробе вируса полиомиелита. Некоторые реовирусы, аденовирусы, а также неполио-энтеровирусы могут проявлять ЦПЭ на клетках L20B и затруднять идентификацию выделенных изолятов и интерпретацию результатов исследования. Такие изоляты следует направить в соответствующую референс-лабораторию для заключительного исследования.

В лабораторной практике часто используют метод адсорбции исследуемого материала на клеточном монослое. При использовании этого метода из флакона/пробирки удаляют ростовую среду, ополаскивают монослой стерильным ФСБ, вносят исследуемую пробу и инкубируют флакон при температуре 36 °С в течение 1 ч. Таким образом, создают лучшие условия для адсорбции вируса клетками, если он присутствует в пробе. После истечения срока инкубации в каждый флакон/пробирку вносят необходимое количество поддерживающей среды. Применение этого метода может способствовать выявлению вируса при его незначительных количествах в исследуемом материале, а также ускорить проявление ЦПЭ, по крайней мере, на 1 сутки. Следует иметь ввиду, что при использовании этого метода, в результате дополнительных открываний крышек, во много раз возрастает вероятность контаминации (перекрёстной вирусной или бактериальной). Его рекомендуется проводить в ламинарном шкафу. Ввиду высокого риска контаминации этот метод не следует использовать для пассирования или инокуляции изолятов вирусов.