IV. Серологическая диагностика

Диагностика

Диагноз ставят на основании анализа эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных, результатов лабораторного исследования. Следует учитывать, что для овец характерно молниеносное переболевание. Хотя клиника (резкое повышение температуры, отеки в области шеи, подгрудка, живота, кровянистые истечения из естественных отверстий), случаи внезапного падежа и характерные патизменения при вынужденном убое не являются основными в диагностике, но служат сигналом для проведения соответствующих противоэпизоотических мер. Главный метод постановки диагноза - бактериологический. В настоящее время для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы используют серологические, биохимические, микробиологические исследования, определение чувствительности к различным антибиотикам и бактериофагам, а также постановку биопробы на лабораторных животных.

Проведение прижизненной диагностики возможно у свиней (и человека). Для этого подкожно вводят аллерген антраксин, приготовленный из вакцинного штама СТИ, в дозе 0,2 мл в области средней трети наружной поверхности уха. Учет реакции ведут через 6-24 часа при помощи осмотра и измерения. Положительным считается результат при гиперемии места инъекции, инфильтрации >10 мм в диаметре и утолщении кожной складки ≥3 мм. Отсутствие гиперемии, отека и утолщение <2 мм служит основанием для опровержения диагноза. При сомнительном результате (наличие гиперемии и инфильтрации <10 мм, увеличение кожной складки до 3 мм) животных исследуют повторно через 6-24 часа. Если двукратно “±” -животных считают больными.

Материал для бактериологического исследования должен быть без признаков разложения и отобран со строгим соблюдением мер предосторожности. Его отправляют в лабораторию с нарочным и в срочном порядке. От трупа посылают ухо со стороны, на которой лежит погибшее животное. При этом предварительно у основания перевязывают выше и ниже линии отреза на расстоянии 2-2,5 см. Отрезают между лигатурами стерильным инструментом и сразу прижигают раскаленным железом или фломбируют. Не допускается попадание капель крови на землю и окружающие предметы. При подозрении на сибирскую язву вскрытие трупа запрещено. Если это произошло, то от трупа или туши берут кровь, селезенку, можно другие паренхиматозные органы, перевязанный фрагмент кишечника, регионарные лимфоузлы с характерными патизменеиями, пораженные участки кожи 5см × 5см. От свиней - заглоточные, подчелюстные, реже шейные и брыжеечные лимфатические узлы, а также отечную ткань. Патматериал консервируют в соотношении 1:5 30-40%-ным водным раствором химически чистого глицерина или стерильным вазелиновым маслом, кишечник, кроме того, насыщенным солевым раствором. Упаковка тройная: стеклянная тара с притертой крышкой, металлический контейнер с подстилкой, смоченной дезраствором, ящик из дерева. При этом составляют сопроводительный документ. Также отправляют нефиксированные высушенные мазки крови (3 толстых, 3 тонких), которые заворачивают в пергаментную бумагу с указанием, что мазок нефиксирован. Трупы мелких, пушных животных отправляют целиком. Исследуют также почву, фураж, воду, шерсть и кожевенно-меховое сырье.

I. Для микроскопии препараты окрашивают:

Вегетативные формы

a) по Граму - бумага, пропитанная спиртовым генцианвиолетом, на 1-2 мин → раствор Люголя 1-2 мин → 96%-й этанол 30-45 с → дист. вода → фуксин Пфейффера 1-2 мин. Микрокартина: неподвижные темно-фиолетовые палочки, соединенные в цепочки;

б) по Романовскому-Гимза - фиксация этанолом 15 мин или смесью Никифорова (спирт:эфир 1:1) 10-15 мин → под препарат краску Романовского-Гимзы 15-20 мин. Микрокартина: клетка темно-синяя, капсула розовая.

Споровые формы

а) метод Пешкова - окраска метиленовым синим с подогреванием до закипания → диствода → 1%-й нейтральрот 10 с. Микрокартина: споры синие, вегетативные клетки красные;

б) метод Ауески - нефиксированный мазок обрабатывают 0,5%-м раствором HCl 2-3 мин при подогревании → диствода → фиксация над пламенем → карболовый фуксин Циля при подогревании 7-8 мин → 5%-я H₂SO₄5-7 мин → дист. вода → метиленовый синий 4-5 мин. Микрокартина: споры красные, вегетативные клетки синие;

в) метод Меллера - 5%-я хромовая кислота при легком подогревании 10 мин → дист. вода → на фильтровальную бумагу карболовый фуксин → подогревают до паров → 2-3 раза (всего 7 мин) → 5%-я H₂SO₄5-7 с → дист. вода → метиленовый синий 3 мин. Микрокартина: споры розово-красные, клетки синие;

г) метод Вальдмана - синька Леффлера до кипения → дист. вода → 1%-й водный нейтральрот 30 с. Микрокартина: споры синие, клетки красные;

На выявление капсулы

а) экспресс-метод Ребигера - окраска 15-20 с формализированным генцианвиолетом. Микрокартина: капсула красно-фиолетовая, клетка темно-синяя;

б) метод Ольта - 2%-й сафронин при подогревании 1-2 мин. Микрокартина: капсула бледно-желтая, клетка красно-коричневая;

в) метод Михина - щелочная синька Леффлера до паров → 5-6 мин. Микрокартина: капсула розовая, клетка синяя.

II. Культуральные свойства

Bac. anthracis растет на обычных ИПС

МПА	МПЖ	МПБ
Матовые серо-белые R-колонии, напоминающие голову медузы	Разжижение желатина в виде перевернутой елочки	Хлопья, оседающие на дно пробирки в виде рыхлого осадка, похожего на комочек ваты. Бульон прозрачный

Также выделяет NH₃, H₂S, ферментирует молоко, глюкозу, сахарозу, трегалозу, фруктозу.

III. Постановка биопробы

Одновременно с посевом на среды проводят биопробу. Для чего исследуемый материал суспензируют и вводят под кожу 2м белым мышам в области спины по 0,2-0,5 мл или 2м морским свинкам (реже кроликам) в области живота по 0,5-1,0 мл. Учет - в течение 10 дней. Гибель - на 1-3е сутки. Трупы вскрывают, готовят мазки, делают посевы, микроскопируют.

IV. Серологическая диагностика

Из серологических методов применяют:

1. Реакция преципитации (РП, реакция Асколи, реакция кольцепреципитации, реакция термопреципитации) - ставится с известной биофабричной преципитирующей сывороткой, содержащей АТ-преципитины, и исследуемым экстрактом, в котором определяется сибироязвенный антиген (преципитиноген). Используется как несвежий патологический материал, так и свежий (в т.ч. молоко, кожевенно-меховое сырье). Последний предварительно помещают на сутки в термостат (+37^оС).

МЕТОДЫ ЭКСТРАКЦИИ АНТИГЕНОВ

Г о р я ч и й 1-2 г измельченного патматериала + 0,9%-й NaCl (1:10) Кипящая водяная баня 30-40 мин +100^оС Фильтрация через асбестовую вату

Х о л о д н ы й 1-2 г измельченного патматериала(растертого с песком) + 0,9%-й NaCl + 0,3%-й фенол 18-24 часа +20^оС Фильтрация через асбестовую вату

Реакция ставится одновременно в 4х пробирках Уленгутта (диаметр 0,4-0,5 см) методами на- и подслаивания:

I. Сибиреязвенный АГ + сибиреязвенная преципитирующая сыворотка (контроль)

II. Сибиреязвенный АГ + физраствор (контроль АГ)

III. Сибиреязвенная преципитирующая сыворотка + физраствор (контроль АТ)

IV. Сибиреязвенная преципитирующая сыворотка + испытуемый экстракт

Метод наслаивания

В пробирку вносят 0,2-0,3 мл испытуемого экстракта, а пастеровскую пипетку с сывороткой опускают на дно и медленно выпускают жидкость.

Метод подслаивания

В пробирку наливают 0,3-0,5 мл сыворотки. После чего пипеткой не спеша по стенке наслаивают антиген в таком же объеме так, чтобы в итоге получилась четкая граница между 2мя слоями жидкости.

Учет реакции - в среднем через 2-15 мин. “+” результат - белое кольцо преципитации на границе между сывороткой и исследуемым экстрактом.

2. РИФ (реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - используется реже, менее эффективна.

3. ПЦР (полимеразная цепная реакция) - высокочувствительная тест-система (позволяет обнаружить до 10-100 бактериальных клеток в пробе и дифференцировать капсульные штаммы от бескапсульных), но энерго- и ресурсоемкая.

Идентификация Bac. anthracis от почвенных сапрофитных бацилл (антракоидов - Bac. cereus, megaterium, mycoides, subtilis)

№	С в о й с т в а	Bac. anthracis	С а п р о ф и т ы
1.	Патогенность	+	-
2.	Наличие капсулы	+	-
3.	Подвижность	-	+
4.	Чувствительность к пенициллину	+ (феномен “жемчужного ожерелья”)	-
5.	Лизис бактериофагами (К-ВИЭВ, γ-МВА, Fah-ВНИИВВиМ)	+	-
6.	Гемолитические свойства	-	+
7.	РИФ	+	-