II. Материалы и методы

В качестве исследуемого материала были взяты красные сухие вина, произведенные в Отделе микровинификации Депертамента Энологии ТУМ из двух сортов винограда: Фетяска Нягрэ и Рара Нягрэ.

Методы выявления и идентификации дрожжей рода Brettanomyces можно разделить на микробиологические и молекулярные. Микробиологические методы включают бактериоскопию и культивирование на элективных и дифференциально-диагностических средах с последующим изучением морфологических данных и физиолого-биохимических характеристик.

2.1. Бактериоскопический метод: Для предварительной оценки состояния исследуемого материала перед посевом оценивают его морфологию. Для обнаружения дрожжевых клеток используют нативные и окрашенные препараты. Нативные препараты изучают в раздавленной капле с помощью фазово-контрастной микроскопии (рис. 2 а). Для этого на обезжиренное предметное стекло наносят каплю исследуемой жидкости и, при необходимости, добавляют каплю красителя. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха, и жидкость не выступала за края покровного стекла. Изучают морфологические особенности микроорганизмов: форму и размеры клеток, характер размножения, наличие вакуолей и липидных включений. Другой способ - иммерсионная световая микроскопия. Для этого мазок окрашивают по Граму: на обезжиренное предметное стекло наносится капля исследуемой жидкости (суспензия культуры с питательной среды, супернатант и т.д.) После высыхания на открытом воздухе мазок фиксируется в пламени горелки и окрашивается в 4 этапа согласно инструкции. В результате в поле зрения будут хорошо видны грамположительные (фиолетового цвета) круглые или овльные клетки, удлинённые и разветвленные цепи псевдомицелия (рис.2 б). [5] 

а)   б)

Рисунок 2 – Клетки дрожжей рода Brettanomyces.

а) фазово-контрастная микроскопия. б) окраска мазка по Граму.  

2.2. Культуральный метод: Для выделения дрожжей рода Brettanomyces использовали следующие питательные среды: Сабуро 4% глюкозный агар, Malt Extract Agar Base (Основа солодового агара), и FastOrange^TM Yeast Agar (Агар для определения дрожжей).  Посевы осуществлялись на поверхности питательных сред в чашках Петри. По 1,0 мл анализируемого образца, наносили на агар, распределяли равномерно стеклянным шпателем, подсушивали и инкубировали при оптимальной температуре 7 суток. После инкубации дрожжей проводили фенотипическую оценку и количественное определение колоний, которое осуществляли прямым подсчетом, затем их микроскопировали (рис.3).