Приспособленность меняется постепенно

 

Начнем с самого масштабного и самого известного эволюционного эксперимента. В 1988 году группа биологов из Университета штата Мичиган под руководством Ричарда Ленски начала – и продолжает по сей день – уникальный эксперимент на бактериях, который позволил с небывалой доселе детальностью проследить ход эволюции как на уровне генома (накопление мутаций), так и на уровне целого организма (развитие адаптаций).

Эксперимент проводится параллельно с 12 популяциями кишечной палочки Escherichia coli. Эта бактерия – обычный обитатель кишечника теплокровных животных, включая человека. Все 12 подопытных популяций живут в аэробных условиях[49] в жидкой прозрачной среде, где единственной пищей является глюкоза. Именно количество глюкозы является лимитирующим фактором, ограничивающим размножение микробов. С интервалом в сутки из каждой популяции берут небольшую часть (0,1 мл содержимого колбы) и пересаживают в новую колбу с 9,9 мл свежей питательной среды. Там бактерии быстро размножаются, пока не исчерпают запасы глюкозы. Таким образом, в течение каждого суточного цикла начальный период изобилия, когда численность популяции быстро растет, сменяется периодом голода, когда бактерии перестают размножаться и их численность стабилизируется. Численность бактерий оценивают по мутности среды – обычный и весьма надежный метод при наличии соответствующего оборудования.

Периодически часть каждой популяции замораживают при −80 °C (что ничуть не вредит здоровью микробов) и сохраняют для последующего изучения. Это мудро, потому что аналитические методики – в том числе методики секвенирования («прочтения») геномов – сейчас стремительно развиваются и столь же стремительно дешевеют.

Регулярно проводится и оценка приспособленности. Для этого сравнивают скорость размножения подопытных и контрольных бактерий, причем в роли вторых выступают размороженные предки первых – исходный штамм, из которого были взяты родоначальники всех 12 экспериментальных популяций.

Кишечные палочки выгодно отличаются от баобабов тем, что позволяют Ленски и его коллегам ежегодно получать интересные результаты и публиковать статьи в ведущих журналах. Так, в 2009 году они опубликовали в Nature отчет об эволюции одной из 12 популяций (Barrick et al., 2009). К этому времени длительность эксперимента уже была достаточной для того, чтобы каждая из возможных точечных мутаций (нуклеотидных замен) успела произойти в популяции более одного раза[50].

Авторы следили за темпом закрепления мутаций и изменением приспособленности. Напомним, что возникновение мутации и ее закрепление – не одно и то же. Далеко не всякая возникшая мутация закрепляется (фиксируется) в популяции. Каждая мутация изначально возникает только у одного микроба. Чтобы мутация зафиксировалась, т. е. достигла 100‑процентной частоты, потомки этого микроба должны вытеснить всех остальных микробов в своей колбе. Вредная мутация, скорее всего, будет отсеяна отбором. Полезная мутация под действием отбора может закрепиться, но может и случайно потеряться, пока ее носители еще не успели как следует размножиться. Наконец, нейтральные мутации должны фиксироваться с постоянной скоростью, равной скорости мутирования (обо всем этом мы говорили в главе 1).

За первые 20 тыс. поколений в подопытной популяции зафиксировалось 45 мутаций, в том числе 29 однонуклеотидных замен и 16 иных мутаций (вставок, выпадений, инверсий, встраиваний мобильных элементов). Самое интересное, что скорость накопления мутаций на этом этапе была постоянной. Приспособленность вела себя иначе: сначала она быстро росла, а затем ее рост замедлился (см. рисунок).

Постоянная скорость фиксации, согласно теории, характерна для нейтральных мутаций. Однако все 45 мутаций не могли быть нейтральными. Ясно, что по крайней мере некоторые из них были полезными – об этом свидетельствует рост приспособленности. Полученные результаты трудно увязать и с гипотезой о том, что все 45 мутаций были полезными. Ведь в этом случае обе величины – приспособленность и число накопленных мутаций, – скорее всего, должны были бы меняться сходным образом, т. е. или расти с постоянной скоростью, или параллельно замедляться.

Простейшее объяснение состоит в том, что среди 45 зафиксировавшихся мутаций большинство были нейтральными, а некоторые – полезными. Основная масса полезных мутаций зафиксировалась вскоре после начала эксперимента, т. е. после попадания микробов в новые для них условия, к которым они были плохо приспособлены. Но возможности для «полезного мутирования» быстро исчерпались, и в дальнейшем фиксировались в основном нейтральные мутации.

Есть, однако, четыре аргумента против такого объяснения.

 

1. В случае преобладания нейтральных мутаций должно быть повышено число синонимичных нуклеотидных замен. Вопреки этим ожиданиям все без исключения зафиксировавшиеся мутации в кодирующих областях генов оказались значимыми (несинонимичными). Резкое преобладание значимых замен над синонимичными – это характернейшая «подпись», оставляемая в геноме положительным отбором.

2. В случае преобладания нейтральных мутаций следует ожидать, что во всех 12 экспериментальных популяциях за 20 тыс. поколений мутации зафиксировались в разных генах. Напротив, мутации в одних и тех же генах, закрепившиеся независимо в разных популяциях, будут доводом в пользу того, что мутации фиксировались под действием положительного отбора, а не генетического дрейфа (т. е. мутации были полезными). Чтобы проверить это, авторы отсеквенировали у бактерий поколения № 20 000 из остальных одиннадцати экспериментальных популяций 14 генов, в которых у первой популяции закрепились мутации. Оказалось, что в большинстве случаев в других популяциях эти гены тоже изменились.

3. Если бы большинство мутаций были нейтральными, наблюдалась бы значительная внутрипопуляционная изменчивость по этим локусам (потому что полезные мутации под действием отбора фиксируются быстро, а нейтральные сначала должны долго «случайно блуждать» между нулевой и 100‑процентной частотой). Это предположение не подтвердилось.

4. При помощи генной инженерии авторы смогли напрямую определить степень полезности девяти мутаций из рассматриваемых 45. Эти мутации искусственно внедряли в геном предкового штамма. В восьми случаях из девяти приспособленность бактерий резко повысилась[51]. Что касается девятой мутации, то авторы думают, что она тоже полезна, но не сама по себе, а в сочетании с другими мутациями, потому что точно такая же мутация закрепилась у других подопытных популяций.

 

 

 

Накопление мутаций (черные линии и кружки) и рост приспособленности (серые линии и квадраты) в экспериментальной популяции. По горизонтальной оси – номер поколения. Видно, что число зафиксировавшихся мутаций росло линейно (тонкие ломаные линии очерчивают 95‑процентные доверительные интервалы линейной модели). Приспособленность сначала росла очень быстро, а потом ее рост замедлился. «Прыжки» серых квадратов вверх и вниз относительно серой линии не выходят за пределы статистической погрешности, т. е. не требуют специальных объяснений. На маленьком графике в правом нижнем углу показано резкое ускорение накопления мутаций начиная примерно с поколения № 26 000, когда в популяции зафиксировалась мутация, повышающая темп мутагенеза. Из Barrick et al., 2009.

 

Таким образом, в течение первых 20 тыс. поколений в популяции фиксировались преимущественно полезные мутации, причем их фиксация шла с постоянной скоростью. Замедление роста приспособленности, очевидно, было связано с тем, что средняя степень полезности мутаций постепенно снижалась. Наиболее радикальные адаптивные изменения произошли в течение первых 2 тыс. поколений, а затем происходила более тонкая настройка.

До сих пор речь шла только о первой половине эксперимента. Во второй его половине эволюционная динамика популяции резко изменилась. Дело в том, что после 26 тыс. поколений зафиксировалась мутация в гене mutT. Этот ген кодирует белок, участвующий в репарации (починке) ДНК. В результате частота мутирования выросла примерно в 70 раз (от 1,6×10⁻¹⁰ до 1,1×10⁻⁸ на нуклеотид за поколение). Как следствие, более чем на порядок выросла и частота фиксации мутаций. В течение второй половины эксперимента зафиксировалось 609 мутаций – в 13,5 раза больше, чем за первые 20 тыс. поколений.

Аналогичные мутации, увеличившие темп мутагенеза, закрепились и в нескольких других экспериментальных популяциях. Из этого следует, что рост темпов мутагенеза дал бактериям адаптивное преимущество. Это, между прочим, противоречит распространенной идее о том, что в стабильных условиях организмам было бы выгодно[52] снизить темп мутирования до нуля – и этого не происходит только из‑за технической невозможности обеспечить абсолютную точность копирования ДНК.

 

–––––

Мутаторы

Мутации, повышающие скорость мутирования, закрепляются во многих эволюционных экспериментах на бактериях. Гены (точнее, генетические варианты – аллели), несущие такие мутации, называют аллелями‑мутаторами или просто мутаторами. Аллелем‑мутатором может стать любой ген, нормальная работа которого важна для точной репликации или репарации, если его слегка «подпортит» случайная мутация.

Нужно иметь в виду, что «полезность» мутаторов не прямая, а косвенная. Сама по себе повышенная скорость мутагенеза снижает приспособленность организмов, потому что большинство мутаций, как известно, вредны. Все очень просто: чем интенсивнее мутагенез, тем больше мутаций у потомков и, следовательно, тем ниже их средняя приспособленность. Это и значит, что мутатор не приносит прямой пользы – наоборот, он приносит прямой вред. Косвенная же польза заключается в том, что нет‑нет да и возникнет у какого‑нибудь носителя аллеля‑мутатора редкая, маловероятная полезная мутация. Причем настолько полезная, что ее польза перевесит вред, приносимый мутатором напрямую. Поскольку полезная мутация маловероятна, она скорее возникнет у носителя аллеля‑мутатора, чем у организма с низкой скоростью мутирования. В результате адаптивное преимущество получит организм, несущий редкую полезную мутацию, а заодно и аллель‑мутатор – в качестве неприятной, но неизбежной «нагрузки». Этот организм и его потомки будут размножаться быстрее других, постепенно вытесняя из популяции конкурентов и распространяя в генофонде обе свои генетические особенности – полезную мутацию и аллель‑мутатор. Генетики называют такой способ распространения аллелей hitchhiking – езда автостопом. Имеется в виду, что мутатор «едет автостопом» на полезной мутации, распространяясь в генофонде вопреки тому, что сам по себе он вообще‑то вреден.

«Автостоп» прекрасно работает в бесполых популяциях, где связку «полезная мутация – аллель‑мутатор» невозможно разорвать. Обычно именно с такими бактериями – бесполыми, нарочно лишенными способности к горизонтальному переносу генов – и работают экспериментаторы. В эксперименте Ленски тоже используются бесполые кишечные палочки. Если бы бактерии могли меняться генами, эволюционные судьбы двух аллелей не были бы столь неразрывными. Обязательно появились бы бактерии, несущие полезную мутацию, но не имеющие мутатора. Эти бактерии стали бы вытеснять тех, у кого два аллеля остались «в связке».

При действующем горизонтальном переносе генов мутатору куда труднее зафиксироваться. Он может даже быть полностью вытеснен из генофонда – конечно, если не успеет до этого момента сгенерировать у кого‑то из своих носителей еще одну полезную мутацию.

–––––

 

Мутация, повысившая темп мутагенеза, увеличила вероятность возникновения новых полезных мутаций, когда простые (высоковероятные) пути для этого уже были пройдены. И в этом состояло единственное благо от ускорения мутагенеза. Но при этом в качестве побочного эффекта должно было вырасти число вредных и нейтральных мутаций.

Поэтому следовало ожидать, что теперь большинство фиксирующихся мутаций будут не полезными, а нейтральными. Как мы помним, скорость фиксации нейтральных мутаций в популяции равна скорости мутагенеза. Действительно, в первые 20 тыс. поколений фиксировалось очень мало нейтральных мутаций, а большая часть из 609 «поздних» мутаций оказались нейтральными.

Результаты эксперимента оказались во многом неожиданными. Например, мало кто ожидал, что постоянный темп накопления полезных мутаций может сопровождаться замедляющимся ростом приспособленности или что соотношение темпов фиксации нейтральных и полезных мутаций может так резко меняться. Очевидно, количественные соотношения между разными аспектами эволюционного процесса (нейтральностью и адаптивностью, дрейфом и отбором, темпами изменений на уровне генотипа и фенотипа) могут быть более сложными, неоднозначными и переменчивыми, чем предполагалось.

 

Как работает эпистаз

 

Еще об одном интересном результате Ленски и его коллеги сообщили в 2011 году (Waads et al., 2011). Ученые проследили, как организмам удается иногда выходить из «ловушек локального оптимума». Трудно придумать гипотетическую схему, в которой популяция начнет спускаться вниз по ландшафту приспособленности, потому что впереди замаячит более перспективная вершина: ведь спустившиеся особи должны вытесняться менее прозорливыми и ушлыми конкурентами. Но жизнь настойчиво твердит, что ловушки локального оптимума преодолимы, а эксперименты показывают, как это происходит. В итоге победа в эволюционном соревновании достается не тем, кто лучше приспособился здесь и сейчас, а тем, кто, поначалу проигрывая, сохранил лучшие возможности для дальнейшей эволюции. И здесь помогает эпистаз.

Как мы помним, одно из достоинств эксперимента Ленски в том, что часть бактерий периодически замораживают и сохраняют в таком виде для дальнейших исследований. В любой момент их можно оживить и использовать в опытах. Это открывает потрясающие возможности. Например, можно напрямую сравнивать приспособленность ныне живущих бактерий, которые уже более 50 тыс. поколений эволюционировали в своих колбах под присмотром ученых, с их далекими предками. Кроме того, любое эволюционное событие, зарегистрированное в ходе эксперимента, можно многократно «проигрывать заново», размораживая предков и наблюдая, произойдет ли у них это событие снова. Это позволяет отделять случайные и маловероятные события от закономерных и высоковероятных.

Ленски и его коллеги «проиграли заново» эволюцию нескольких подопытных бактерий, замороженных по прошествии 500 поколений основного эксперимента. Все бактерии происходили из одной экспериментальной популяции. К 500‑му поколению в этой популяции уже появилось несколько полезных мутаций, которые впоследствии достигли 100‑процентной частоты. Кроме того, на этом этапе эксперимента, как и на любом другом, в популяции присутствовали обладатели менее удачных мутаций, которые впоследствии были вытеснены.

Напомним также, что бактерии были лишены генов, разрешающих горизонтальный перенос, так что обмениваться генами, комбинируя удачные варианты, они не могли. Это позволило генетикам выделить среди замороженных микробов поколения № 500 «будущих победителей» – бактерий, обладающих мутациями, которые впоследствии достигли 100‑процентной частоты в популяции (будем называть их прапобедителями), и «будущих проигравших» – тех, чьи потомки впоследствии исчезли из популяции (или пралузеров). Выращивали по два штамма каждого типа, т. е. всего четыре линии, выведенные из двух прапобедителей и двух пралузеров.

Размороженные прапобедители имели полезные мутации в генах topA и rbs. Первый ген кодирует фермент топоизомеразу, который помогает расплетать и снова сплетать двойную спираль ДНК в ходе транскрипции (считывания генетической информации). От свойств топоизомеразы зависит активность многих генов. Второй ген, rbs, – это даже не ген, а целый оперон[53], отвечающий за усвоение рибозы.

Мутация topA, характерная для прапобедителей, сама по себе дает 13‑процентный выигрыш в приспособленности по сравнению с исходным штаммом бактерий. Это было установлено при помощи генно‑инженерных манипуляций: предку «пересадили» эту мутацию, не меняя остального генома, и устроили соревнование. Модифицированный штамм переиграл исходный.

Все мутации в опероне rbs представляют собой делеции (выпадения участков ДНК), дающие выигрыш в 1–2 %. В ходе эксперимента бактерий кормили чистой глюкозой, а не рибозой, поэтому потеря части рибозного оперона могла быть выгодна: она снижала расходы клетки на синтез лишних белков.

У обоих штаммов «проигравших» тоже была мутация в гене topA, но она отличалась от той, что была у прапобедителей. Авторы обозначили ее topA1. Она тоже полезна сама по себе, но повышает приспособленность не на 13, а только на 5 %. У одного из двух штаммов пралузеров была мутация в опероне rbs, и снова не такая, как у прапобедителей. Другие мутации ученым не открылись.

Для начала авторы сравнили приспособленность (скорость роста) штаммов прапобедителей и пралузеров. Казалось бы, у первых приспособленность должна быть выше. Как ни странно, результат оказался противоположным. Выяснилось, что пралузеры превосходят по приспособленности предковый штамм на 20–23 %, тогда как прапобедители опережают предка лишь на 13–15 %. Таким образом, на промежуточном зачете после 500 поколений пралузеры вырвались вперед, сильно обогнав «будущих победителей». Это, конечно же, означает, что у «будущих проигравших» имелись какие‑то полезные мутации, которые ученым пока не удалось обнаружить, причем польза от них перекрывает известный выигрыш от мутаций topA и rbs.

Авторы рассчитали, что если бы репродуктивное преимущество пралузеров над прапобедителями, наблюдавшееся после 500‑го поколения, сохранялось и впредь, то пралузеры полностью вытеснили бы прапобедителей примерно за 350 поколений, т. е. к 850‑му поколению. Как мы знаем, этого не случилось. Все произошло наоборот. Очевидно, потомкам прапобедителей удалось менее чем за 350 поколений приобрести новые полезные мутации, которые позволили им обогнать потомков пралузеров в эволюционном соревновании. Естественно, возникает вопрос: почему потомки пралузеров сами не приобрели аналогичных мутаций, ведь у них было на это ровно столько же времени и хорошая фора?

Авторы предположили, что разгадка может скрываться в различном влиянии мутаций, имеющихся у прапобедителей и пралузеров, на дальнейшие эволюционные перспективы. Эффекты действия генов, в том числе и мутантных, накладываются друг на друга; напомним, что это явление называют эпистазом. Степень полезности той или иной мутации не абсолютна: она зависит от генетического контекста. Скажем, мутация А может быть полезной при наличии мутации Б, но вредной при ее отсутствии (или наоборот). Можно предположить, что полезные мутации, изначально обеспечившие быстрый рост приспособленности у пралузеров, снизили способность бактерий к дальнейшей адаптации. Например, они могли сглаживать или даже сводить на нет эффекты каких‑то других, еще не возникших мутаций, полезных в других генетических контекстах. При этом мутации прапобедителей сами по себе были менее полезны, но зато они не закрыли дорогу для будущих приобретений.

Можно ли проверить эту гипотезу? Да! Генетики провели несколько остроумных экспериментов, в которых весьма наглядно показали счастливую мутационную судьбу прапобедителей и злополучную – пралузеров. Мутационное счастье заключалось в повышенной выгоде от новоприобретений, а злосчастье – в пониженной.

Для начала геномы бактерий каждого из четырех штаммов пометили точечными мутациями, не влияющими на приспособленность, но позволяющими различать штаммы по окраске[54]. Затем меченых (белых и красных) бактерий из одного и того же исходного штамма (либо прапобедителей, либо пралузеров) смешивали в соотношении 50:50 и позволяли эволюционировать в тех же условиях, что и в основном эксперименте. В каждом поколении регистрировалось соотношение белых и красных бактерий. До тех пор пока в эволюционирующей популяции не возникало новых полезных мутаций, это соотношение испытывало лишь небольшие случайные колебания под действием генетического дрейфа. Но, как только возникала первая полезная мутация, ситуация резко менялась. Фокус тут в том, что любая полезная мутация изначально возникает у какой‑то одной бактерии. «Повезет» либо красной, либо белой бактерии. Потомки бактерии с полезной мутацией начинают быстро размножаться, и, соответственно, в популяции начинает расти доля либо белых, либо красных микробов (точнее, микробов, образующих белые или красные колонии на соответствующей среде). При этом ученые получают сразу две уникальные возможности: 1) с большой точностью поймать момент возникновения первой полезной мутации; 2) оценить степень ее полезности по скорости, с которой соотношение красных и белых будет отклоняться от исходного 50:50.

Нужно подчеркнуть, что речь здесь идет только о первой полезной мутации. Пока полезная мутация всего одна, соотношение белых и красных уходит от исходного состояния по экспоненте и всю ситуацию можно анализировать при помощи достаточно простой математики. Как только появляется вторая полезная мутация, картина становится слишком сложной.

При помощи этой великолепной методики авторы показали, что скорость появления полезных мутаций в линиях прапобедителей и пралузеров одинакова, однако средняя полезность первой полезной мутации, возникающей в штаммах прапобедителей, заметно выше, чем у пралузеров. Иными словами, экспоненциальный рост или снижение соотношения белых и красных у прапобедителей в среднем шли быстрее, чем у пралузеров, вплоть до появления второй полезной мутации, которая «смазывала» картину. У победителей первая полезная мутация повышала приспособленность в среднем на 6 %, а у лузеров – только на 4 %. В прямых конкурентных экспериментах между прапобедителями и пралузерами выяснилось, что первые теперь в среднем на 2,1 % более приспособлены, чем вторые. Это значит, что их победа была не случайностью, а закономерным следствием более высокого «эволюционного потенциала». Это подтверждает предположение о том, что «генетический контекст» у прапобедителей более благоприятен для последующей адаптивной эволюции. Разумеется, полезные возникавшие мутации были разными и далеко не во всех случаях авторам удалось их идентифицировать.

Исследователям удалось расшифровать один конкретный пример взаимного влияния мутаций (эпистаза) из числа тех, что обеспечили итоговый выигрыш прапобедителей. Оказалось, что у них в шести из 20 линий потомков за 883 поколения закрепились полезные мутации в гене spoT – многофункциональном регуляторе активности генов. Мутация в этом гене закрепилась также и в основном долгосрочном эксперименте. Однако ни в одной из 20 линий потомков пралузеров мутации в гене spoT не зафиксировались. При помощи генно‑инженерных экспериментов удалось показать, что мутация spoT оказывается полезной в сочетании с мутацией topA, характерной для штаммов прапобедителей, но не приносит пользы в сочетании с мутацией topA1, характерной для пралузеров.

Получается, что тот эволюционный путь, по которому пошли пралузеры, хотя и обеспечил им преимущество на ранних этапах эксперимента, оказался менее перспективным, в частности потому, что лишил бактерий возможности повысить свою приспособленность за счет приобретения мутаций в гене spoT.

Таким образом, в долгосрочной перспективе вероятность закрепления той или иной мутации зависит не только от ее непосредственного влияния на приспособленность «здесь и сейчас», но и от ее воздействия на эволюционные перспективы, т. е. на вероятность того, что другие мутации, которые могут возникнуть в будущем, окажутся полезными. В результате линии, поначалу вырвавшиеся вперед в эволюционной гонке, в конечном счете могут оказаться в проигрыше. Разумеется, для этого необходимо, чтобы отстающие, но перспективные линии успели приобрести дополнительные полезные мутации раньше, чем их полностью вытеснят более успешные конкуренты.

Эти удивительные результаты перекликаются с палеонтологическими фактами, которые подметил еще в XIX веке русский зоолог В. О. Ковалевский (1842–1883), изучавший эволюцию копытных. Палеонтологическая летопись демонстрирует немало примеров того, как из двух конкурирующих групп, возникших примерно в одно и то же время, сначала добивается успеха одна, но затем ее вытесняет другая. При этом адаптивная эволюция в обеих группах идет в одном направлении (у копытных речь шла о преобразованиях стопы и кисти). В первой успешной группе ключевые приспособления развиваются быстрее, но являются более поверхностными, несбалансированными. Во второй группе, которая поначалу занимает подчиненное положение, аналогичные адаптации развиваются медленнее, но в итоге оказываются более комплексными, слаженными и глубокими (Расницын, 1986). Эту закономерность традиционно объясняли на основе общих представлений о «компромиссном» характере эволюции. Любая адаптация покупается ценой ограничения возможностей для развития других адаптаций. Быстро приобретенные «косметические» адаптации могут перекрыть пути дальнейшего совершенствования, так что весь путь в итоге оказывается тупиковым. Теперь мы видим, как эта закономерность работает на молекулярно‑генетическом уровне.