Реакции, протекающие с участием меченых антигенов или антител

Тесты основаны на выявлении взаимодействия антигена с антителом с образованием иммунного комплекса антиген - антитело по метке одного из участников реакций, выявляемой либо визуально, либо с помощью специальных высокочувствительных приборов, позволяющих количественно выявить меченый субстрат и, следовательно, искомый антиген или антитело. В качестве метки используют либо флюоресцирующий в ультрафиолетовом свете краситель (изоционат флюоресцеина), либо фермент (пероксидаза, щелочная фосфатаза), выявляемый по изменению окраски соответствующего субстрата (иммуноферментный анализ - ИФА), либо изотоп, выявляемый радиометрией (радиоиммунный анализ - РИА).

В отечественных лабораториях в течение многих лет используется иммунофлюоресцентный метод, разработанный Альбертом Кунсом и получивший его имя. Одна модификация метода, получившая название прямого метода Кунса, включает обработку материала на предметном стекле (мазок мокроты, срез ткани) меченой флюорохромом диагностической антисывороткой. Если на предметном стекле был искомый антиген, антитела фиксируются на антигене, и после отмывки стекла от несвязавшихся антител антиген выявляется в люминесцентном микроскопе по яркому свечению.

Другая модификация - непрямой метод Кунса - основан на использовании меченой антиглобулиновой сыворотки. От прямого метода Кунса этот вариант отличается тем, что используется немеченая диагностическая сыворотка, а ее присоединение к антигену выявляется с помощью меченой антиглобулиновой сыворотки, выявляющей иммуноглобулин немеченой диагностической сыворотки, присоединившийся к искомому антигену.

Более современные методы выявления антигенов либо антител имеют множество вариантов. Большинство из них используют «твердофазную» технологию, основанную на том, что один из стандартизованных компонентов реакции (антиген или антитело) заранее в производственных фирменных лабораториях фиксируется в лунках специально приготовленных полистироловых или поливинилхлоридных панелей. Исследуемый материал помещается в эти лунки. Для выявления антигена могут быть использованы лунки, в которых фиксированы антитела. Если в материале содержался антиген, то он присоединяется к фиксированным антителам и сам оказывается фиксированным в лунке.

Для выявления этого антигена используются меченые антитела, и после ряда отмывок для удаления несвязывавшихся компонентов эти антитела выявляются в соответствии со своей меткой. Для выявления антител могут быть использованы лунки, в которых фиксирован антиген. Добавленные антитела фиксируются на антигене, остаются в лунке и могут быть выявлены с помощью меченых антиглобулиновых антител. Мы привели примеры вариантов использования твердофазных методов и меченых компонентов реакций. Могут быть и другие варианты.

Так, например, клетки крови или костного мозга могут быть обработаны флюоресцирующими антителами в жидкости. При этом клетки могут быть обработаны разными антителами, помеченными разными флюорохромами. Пропуская такие взвеси через специальный проточный флюориметр, можно одновременно выявить и подсчитать разные виды клеток. Присоединив к проточному флюориметру прибор, именуемый сортером, можно выделить или удалить из взвеси те клетки, которые необходимы исследователю или врачу.

Современные иммунофлюоресцентные, иммуноферментные и радиоиммунные методы отличаются высокой чувствительностью (выявление 0,0005-0,00005 мкг/мл белка), специфичностью, воспроизводимостью, возможностью выявления широкого круга биологических веществ. Современные производственные фирмы готовят все необходимые ингредиенты и оборудование для их использования.

Таким образом, развитие серологических методов диагностики происходит в настоящее время в следующем направлении:

· использование меченых антигенов или антител с помощью флюорохрома, фермента либо радиоактивной метки;

·         постановка реакции на твердофазном носителе - полистероловом планшете с лунками с нанесенными в них антигенами или антителами.

Это позволяет повысить чувствительность метода, автоматизировать постановку реакции и использовать специальную аппаратуру для снятия результатов.

ПЦР-диагностика

кровь серологический антиген фагоцит

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp [8]). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд. пар оснований.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

·         Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

·         Термостабильная ДНК-полимераза - фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.

·         Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

·         Ионы Mg²⁺, необходимые для работы полимеразы.

·         Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции - рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.

Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата. Пирофосфат может ингибировать ПЦР-реакцию [10].

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером (отжиг [11]), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы (см. ниже).

Важнейшая характеристика праймеров - температура плавления (T_m) комплекса праймер-матрица._m - температура, при которой половина ДНК-матриц образует комплекс с олигонуклеотидным праймером. Температуру плавления можно приблизительно определить по формуле

 

,

 

где: n_X - количество нуклеотидов Х в праймере.

В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80°C.

При выборе праймеров желательно придерживаться следующих критериев:

· GC-состав ~ 40-60%;

·         близкие T_m праймеров (отличия не более, чем на 5°C);

·         отсутствие неспецифических вторичных структур - шпилек [12] и димеров [13];

·         желательно, чтобы на 5’-конце был гуанин или цитозин, поскольку они образуют три водородные связи с молекулой матрицы, делая гибридизацию более стабильной.

 

Рис. 1. − Амплификатор для проведения ПЦР

 

ПЦР проводят в амплификаторе - приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР (см. ниже) и последующего хранения амплифицированных молекул при 4°C. Для ПЦР в реальном времени выпускают приборы, оборудованные флуоресцентным детектором. Существуют также приборы с автоматической крышкой и отделением для микропланшет, что позволяет встраивать их в автоматизированные системы.

 

Фотография геля, содержащего маркерную ДНК (1) и продукты ПЦР-реакции (2, 3). Цифрами показана длина фрагментов ДНК в парах нуклеотидов

Обычно при проведении ПЦР выполняется 20-35 циклов, каждый из которых состоит из трёх стадий (рис. 2).

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94-96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5-2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4-5°С ниже их температуры плавления. Время стадии - 0,5-2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

ДНК-полимераза реплицирует <http://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%A0%D0%B5%D0%BF%D0%BB%D0%B8%D0%BA%D0%B0%D1%86%D0%B8%D1%8F_%28%D0%B1%D0%B8%D0%BE%D0%BB%D0%BE%D0%B3%D0%B8%D1%8F%29> матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это - стадия элонгации. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы в направлении от 3' к 5'. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин. Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) теоретически возрастает пропорционально 2ⁿ, где n - число циклов реакции. На самом деле эффективность каждого цикла может быть меньше 100%, поэтому в действительности P ~ (1+E)ⁿ, где P - количество продукта, Е - средняя эффективность цикла.

Число «длинных» копий ДНК тоже растет, но линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент.

Рост требуемого продукта в геометрической прогрессии ограничен количеством реагентов, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов. На последних циклах реакции рост замедляется, это называют «эффектом плато» [14].

· «Вложенная» ПЦР (Nested PCR (англ.)) - применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

·         «Инвертированная» ПЦР (Inverse PCR (англ.)) - используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (легирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

·         ПЦР с обратной транскрипцией (Reverse Transcription PCR, RT-PCR (англ.)) - используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из библиотеки РНК. Перед обычной ПЦР проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы и получают одноцепочечную кДНК, которая используется в качестве матрицы для ПЦР. Этим методом часто определяют, где и когда экспрессируются данные гены.

·         Асимметричная ПЦР (англ. Asymmetric PCR) - проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

·         Количественная ПЦР (Quantitative PCR, Q-PCR (англ.)) - используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.

·         Количественная ПЦР в реальном времени (Quantitative real-time PCR) - в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.

·         Touchdown (Step-down) ПЦР (Touchdown PCR (англ.)) - с помощью этого метода уменьшают влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определённой температуре система пройдёт через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.

·         Метод молекулярных колоний (ПЦР в геле, англ. Colony - PCR Colony) - акриламидный гель полимеризуют со всеми компонентами ПЦР на поверхности и проводят ПЦР. В точках, содержащих анализируемую ДНК, происходит амплификация с образованием молекулярных колоний.

·         ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. Rapid amplification of cDNA ends, RACE-PCR)

·         ПЦР длинных фрагментов (англ. Long-range PCR) - модификация ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют две полимеразы, одна из которых - Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть, способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая - ДНК полимераза с 3'-5' экзонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесённые первой.

·         RAPD PCR (англ. Random Amplification of Polymorphic DNA PCR, ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК - используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы, например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы. В этом методе обычно используют один праймер небольшого размера (около 10 п.н.). Этот праймер будет частично комплементарен случайным участкам ДНК исследуемых организмов. Подбирая условия (длину праймера, его состав, температуру и пр.), удаётся добиться удовлетворительного отличия картины ПЦР для двух организмов.

·         PCR с использованием горячего старта (англ. Hot-start PCR - модификация ПЦР с использованием парафина для разделения верхней (содержащей буферный раствор, полимеразу, матрицу и, если необходимо, деионизованную воду) и нижней (содержащей деионизованную воду, праймеры и дезоксирибонуклеотиды) смесей с целью недопущения раннего смешивания компонентов реакции. До начала реакции амплификатор необходимо прогреть до температуры плавления парафина (60-80°C).

Если нуклеотидная последовательность матрицы известна частично или неизвестна вовсе, можно использовать вырожденные праймеры, последовательность которых содержит вырожденные позиции, в которых могут располагаться любые основания. Например, последовательность праймера может быть такой: …ATH…, где Н - А, Т или С.

ПЦР используется во многих областях для проведения анализов и в научных экспериментах [7].

 

Выводы

1. ГНУ СИБНИИЖ является одним из крупнейших научно-исследовательских центров в области сельского хозяйства на территории России.

2. Разработки ГНУ СИБНИИЖ в области кормления, разведения и содержания сельскохозяйственных животных вносят большой вклад в развитие животноводства.

.   Исследования сотрудников иммунобиохимической лаборатории вносят огромный вклад в изучение генотипов животным по ряду локусов, а так же в представление научной общественности об антигенах крови.

.   В ходе прохождения производственной практике мной был получен бесценный опыт в области выделения ДНК, ПЦР-реакций и серологических реакций на антигены крови.