Соматический эмбриогенез и его механизмы

Соматический эмбриогенез - образование в каллусной или суспензионной культуре эмбриоидов, то есть зачатков интактного растения, способных развиваться во взрослое растение. С точки зрения биотехнологии, он имеет много преимуществ перед органогенезом, так как регенерант на основе соматического зародыша полностью сформирован, а побеги надо еще укоренять.

Формирование эмбриоидов (зародышей) из соматических клеток в условиях in vitro впервые наблюдали в суспензионной культуре клеток моркови Ф. Стюард с сотрудниками (1958). Такие зародыши при переносе на соответствующую питательную среду развивались в целые растения. Этот процесс наглядно демонстрирует тотипотентность растительных клеток.

    Соматический эмбриогенез включает стадии развития, аналогичные стадиям при зиготическом эмбриогенезе:

· глобулы,

· сердца,

· торпеды,

· сформированного зародыша молодого проростка.

В некоторых случаях эмбриоиды образуются непосредственно из клеток ткани, введенной в культуру, так называемый прямой эмбриогенез. В других случаях происходит непрямой эмбриогенез: вначале формируется каллус, а уже из него развиваются зародыши. Эмбриоиды образуются из одиночных клеток, расположенных в основном на поверхности каллуса. Окружающие вакуолизированные клетки могут выполнять по отношению к эмбриогенным клеткам функцию ткани- «няньки».

В суспензионных культурах выделяют два основных этапа:

1. сначала из одиночных клеток в результате многократных делений формируются компактные проэмбриогенные комплексы,

2. затем из такого комплекса развивается один или несколько эмбриоидов.

Клетки, дающие начало эмбриоидам, отличаются более плотной цитоплазмой, относительно большим ядром с увеличенным ядрышком, в них присутствуют крупные крахмальные гранулы и мелкие вакуоли. Эти клетки метаболически активны, богаты белками и РНК. Потребность в гормонах на каждом из этапов эмбриогенеза различна.

Проэмбриогенные комплексы образуются в присутствии ауксина, однако переход к формированию эмбриоидов данный гормон ингибирует. Поэтому на втором этапе соматического эмбриогенеза ауксин или исключают из среды, или используют его в очень низких концентрациях.

Предполагают, что прямой эмбриогенез в культуре происходит из клеток, которые уже детерминированы для эмбриогенного развития перед эксплантацией, то есть являются преэмбриогенно детерминированными. Поэтому чтобы произошла экспрессия эмбриогенеза, требуются только благоприятные условия.

Непрямой эмбриогенез идет путем редетерминации (повторной детерминации) дифференцированных клеток, пролиферации каллуса и развития эмбриогенно детерминированного состояния. Тогда необходимы гормоны как для индукции деления клеток, так и для детерминации эмбриогенного состояния.

Клетки молодых проростков, особенно из эпидермиса гипокотиля, представляют собой наиболее удобный материал для получения соматических эмбриоидов. Эта способность клеток уменьшается по мере удлинения срока от начала культивирования.

 Например, у моркови эмбриоиды начинают образовываться через 4-6 недель после получения каллуса, оптимальный возраст культуры для индукции соматического эмбриогенеза - 15-20 недель; 30-40 недельная культура часто теряет свой эмбриогенный потенциал.

 Наиболее ранняя фаза детерминации клетки на эмбриогенный путь развития - приобретение его свойств полярности, или аксилярности. Она поддерживается несколькими механизмами, которые включают активный базипетальный транспорт эндогенного ауксина, градиент БЭП, градиенты ионов Са2+. Важное значение имеют:

· перестройка цитоскелета морфогенных клеток,

· активация протеинкиназы Р34,

· ингибирование фосфорилирования и окончания деления,

· переход клеток в состояние покоя.

 В незрелых зародышах изменяется содержание эндогенных фитогормонов. В регуляции соматического эмбриогенеза очень большую роль играют свет (возможно, посредством активации фитохрома), особенно его спектральный состав, а также экспрессия сигнальных белков. Индуктором эмбриогенеза также может быть слабый постоянный электрический ток. Интересно, что в некоторых ситуациях можно наблюдать органо- и эмбриогенез одновременно. Например, первичный каллус на срезе черешка листа моркови в разных участках давал начало как моно-, так и биполярным органам. В зоне, близкой к перициклу, каллусы дифференцировались как зачатки корней; затем в зоне коровой паренхимы каллусы дифференцировались как зачатки побегов. Значительно позже в субэпидермальной зоне возникали биполярные эмбриоиды. Возможно, такой морфогенез обусловлен эпигенетическим влиянием экспланта на первичные каллусные клетки.

Покрытосеменные

Развитие эмбриона в покрытосеменных делится на несколько этапов. Зиготы делится асимметрично образуя небольшую апикальную клетку и большую базальную клетку. Организационная структура сформирована в шаровой стадии и эмбрион затем переходит к стадии семядоли. Развитие эмбриона отличается в однодольных и двудольных. Двудольные проходят через шаровидные, в форме сердца, и торпедные стадии в то время как однодольные проходят через шаровидные, scuetellar и coleoptilar этапов.

Многие системы культуры вызвать и поддерживать соматического эмбриогенеза путем непрерывного воздействия 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты. АБК, как сообщается, индуцируют соматический эмбриогенез в проростках. После каллусной формирования, культивирования на низком ауксина или гормон свободных средств массовой информации будет способствовать соматического роста эмбриона и образование корней. В однодольных, эмбриогенной способности обычно ограничиваются тканями с эмбриогенным или меристематическим происхождением. Соматические клетки однодольных дифференцироваться быстро, а затем теряют митотические и морфологические возможности. Отличия ауксина чувствительности в эмбриогенном росте каллюса между различными генотипами тем же видом, как показывают переменные ауксиновые ответы могут быть.

Морковь был первым и наиболее понятных видов в отношении путей развития и молекулярных механизмов. Время отслеживания покадрового с помощью Тунена и др. (1994) показали, что морфология компетентных клеток может изменяться в зависимости от формы и плотности цитоплазмы. Пять типов клеток были идентифицированы из эмбриональных суспензии: сферическую цитоплазмы богатых, сферические, овальные вакуолизированной вакуолизированной, удлиненные вакуолизированной и неправильной формы клетки. Каждый тип клеток, умноженное с определенной геометрической симметрии. Они разработаны в симметричные, асимметричные и аберрантно-образных кластеры клеток, которые в конечном счете, эмбрионы, образованные на разных частотах. Это свидетельствует о том, что организованная полярность роста не всегда существует в соматическом эмбриогенезе.

Голосеменные

Развитие эмбриона в голосеменных происходит в три этапа. Proembryogeny включает в себя все этапы до начала суспензорные удлинения. Раннее эмбриональное развитие включает в себя все этапы после суспензорные удлинения  но до развития корневой меристемы. Поздний эмбриональное развитие включает в себя развитие корней и побегов меристемы. Покадровые следящие в Норвегии Spruce Picea пихта показал, что ни единичные цитоплазматические богатые клетки, ни вакуолизированные клетки превратились в эмбрионы. Proembryogenic масса (АЯ), промежуточное звено между неорганизованными клетками и эмбрион, состоящим из цитоплазматических богатых клеток рядом с вакуолизированной клеткой, стимулирует ауксин и цитокинин. Постепенное удаление ауксина и цитокининов и внедрение абсцизовой кислоты (ABA) позволит зародыш с образованием. Использование соматического эмбриогенеза было рассмотрено для массового производства вегетативно размножающихся хвойных клонов и криоконсервации зародышевой плазмы. Однако использование этой технологии для лесовосстановления и питомников хвойных дерев находится в зачаточном состоянии.

 

 

При культивировании in vitro и из клеток экспланта, и из клеток каллуса могут развиться соматические зародыши, или эмбриоиды, которые, как и стеблевые почки, при прорастании дают целые растения. В зависимости от пути образования эмбриоидов (из экспланта или каллуса) по аналогии с органогенезом различают прямой и непрямой путь соматического эмбриогенеза. Морфологические различия между стеблевыми почками и эмбриоидами заключаются в следующем. Эмбриоиды развиваются из соматических клеток как автономные структуры. Для соматических зародышей, как и для зиготических, характерна биполярность (рис.2).

 

Стеблевые почки, развивающиеся и у интактных растений, и в культуре in vitro, монополярны и не автономны, так как связаны сосудистыми тканями с органом растения или каллусной тканью.

 Пример соматического эмбриогенеза in vivo - адвентивная полиэмбриония у цитрусовых. В одном семени может развиваться до сорока зародышей. Обычно один зародыш зиготический. Он формируется от слияния половых клеток и несет признаки материнского и отцовского растения. Остальные зародыши - неполовые, развиваются из клеток нуцеллуса, окружающего зародышевый мешок, и несут признаки только материнского растения. Способность к полиэмбрионии у цитрусовых используют для их клонального размножения. Нуцеллус изолируют и культивируют in vitro в условиях, где происходит индукция образования эмбриоидов из отдельных клеток.

 Образование структур, подобных зародышевым, впервые описал Ф. Стюард в 60-е гг. Культивирование клеток корня моркови в жидкой среде с кокосовым молоком приводило к их быстрому делению и образованию клеточных агрегатов. Внутри этих агрегатов происходила дифференцировка элементов ксилемы, после чего формировались корневые зачатки.

 При переносе культуры на агаризованную среду наблюдалось образование из этих структур побегов, развивающихся в целое растение.

Источником эмбриогенного каллуса у моркови могут быть разные органы: корень, листья, стебель, зиготические зародыши.

 Интересной моделью для изучения соматического эмбриогенеза является лютик - Ranunculus sceleratus. На среде, содержащей кокосовое молоко, в соматических тканях и пыльниках формируется эмбриогенный каллус.

 В течение трех недель как внутри каллуса, так и на его поверхности образуются эмбриоиды, по своему строению напоминающие зиготические зародыши. Такие же эмбриоиды могут формироваться и из клеток суспензионной культуры. При пассировании соматических зародышей на свежую среду индуцируется развитие проростков, у которых по всему стеблю из отдельных эпидермальных клеток без дополнительной индукции формируются многочисленные эмбриоиды.

 У злаков в условиях культивирования эмбриогенный каллус может быть получен из щитков молодых зародышей, помещенных на поверхность агаризованной среды, содержащей 2,4-Д. Соматический эмбриогенез у злаков на примере культурного ячменя был впервые описан в 1970 г. Норстогом.

Различают критические стадии в развитии и прорастании эмбриоидов, индуцированных в каллусной культуре:

 1. Дедифференциация клеток экспланта. Этот период связан с активацией генов, контролирующих деление клеток. В культуральную среду необходимо вводить ауксины (например, для злаков) или ауксины в сочетании с цитокининами (для хвойных), стимулирующие как процесс дедифференциации, так и образования эмбриогенных групп клеток.

 2. Развитие эмбриоидов, происходящее в зонах эмбриогенных клеток и контролируемое генами, последовательно экспрессирующимися на разных стадиях эмбриоидогенеза. На данном этапе культивирования концентрация ауксинов в питательной среде или снижается, или полностью исключается.

3. Прорастание эмбриоидов и развитие растений. В этот период требования к среде и условиям культивирования могут быть различными в зависимости от культивируемого объекта. Так, для развития растений из эмбриоидов цитрусовых в культуре нуцеллуса необходим гиббереллин, а у винограда культивирование проводят при пониженной температуре (t = 4 °С). Чтобы индуцировать прорастание соматических эмбриоидов у злаков и цикламена, необходимо использовать безгормональную среду или среду с низким содержанием ауксинов. Возможность получения соматических зародышей у растений используют для получения искусственных семян или при клональном размножении растений.

На рис. 3 показаны возможные пути преобразования при культивировании изолированных растительных тканей и индукции морфогенеза.

Направление процесса органогенеза in vitro зависит от следующих факторов:

Ø таксономической принадлежности и генотипа исходного растения;

Ø онтогенетического возраста растения;

Ø локализации ткани, использованной в качестве экспланта;

Ø действия физических факторов при культивировании (температура, содержание кислорода, продолжительность и качество освещения);

Ø длительности культивирования;

Ø состава питательной среды.

 Зависимость от таксономической принадлежности наиболее хорошо прослеживается при сравнении особенностей культивирования изолированных органов и тканей у двудольных и однодольных растений. У двудольных растений каллусную ткань способную к органогенезу можно индуцировать не только из меристематических клеток, но из вполне дифференцированных тканей листьев, стебля, корня. У однодольных растений для получения каллусной ткани в качестве эксплантов используют только ткани, содержащие меристематические клетки. На рис. 4 представлена способность к органогенезу разных семейств начиная с наиболее «отзывчивых».

    Роль генотипа в проявлении морфогенной способности в культуре тканей хорошо изучена на примере разных сортов, изогенных и мутантных линий табака, моркови, цветной капусты, пшеницы, риса и других растений. Выявлены соответствующие доноры с высоким морфогенным потенциалом в культуре in vitro.

Зависимость особенностей органогенеза от онтогенетического состояния растения установлена, в частности, при изучении особенностей культивирования листовых эксплантов эчеверии и табака. При культивировании молодых листьев указанных растений происходит образование корней. Из листьев, вычлененных из растений, средних по возрасту, индуцируется развитие и стеблевых почек, и корней. Из листьев, вычлененных из зрелых растений, развиваются только 57 стеблевые почки. Такие различия в характере органогенеза при культивировании на средах одинакового состава определяются содержанием эндогенных фитогормонов в тканях исходного экспланта.

 Уровень эндогенных фитогормонов определяет также зависимость между типом органогенеза и локализацией ткани, используемой в качестве исходного экспланта. При культивировании на среде одного и того же состава сегментов стебля, выделенных из разных частей цветущего растения табака, можно наблюдать проявление разных типов органогенеза. Из сегментов стебля, изолированных от базальной части, формируются вегетативные почки. Из сегментов, выделенных из средней части стебля, регенерируются вегетативные и цветочные почки в определенном соотношении. Из сегментов, изолированных из зон, близких к соцветию, развиваются только цветочные почки.

 Среди факторов питательной среды, влияющих на особенности регенерации в культуре ткани, наиболее важными для регуляции направления морфогенеза являются регуляторы роста. В этом отношении классической является работа, выполненная Скугом и Миллером в 1957 г. Из сердцевинной паренхимы стебля цветущего растения табака была получена каллусная культура, клетки которой могут размножаться и расти на среде с ИУК и кинетином. При наличии в среде разного соотношения этих гормонов наблюдаются следующие особенности (рис. 5.4). Определенное превышение концентрации кинетина над ауксином приводит к образованию стеблевых почек и побегов. Увеличение концентрации ауксина приводит к развитию корней. Промежуточное соотношение концентраций этих фитогормонов поддерживает неорганизованный рост каллусной ткани.

С увеличением продолжительности культивирования тканей утрачивается их способность к регенерации стеблевых и цветочных почек. Гораздо дольше сохраняется способность к ризогенезу.

 C точки зрения биотехнологии соматический эмбриогенез имеет много преимуществ перед органогенезом. Регенерант на основе соматического зародыша полностью сформирован, тогда как побеги, полученные в результате органогенеза надо укоренять, а лишний труд неэкономичен для биотехнологии. Соматический эмбриогенез незаменим и для фундаментальных исследований. Дело в том, что тонкие механизмы морфогенеза в настоящее время представляются еще в некоторой степени «черным ящиком». С помощью суспензионных культур, с которыми чаще всего связано культивирование соматических эмбриоидов, исследователь может получить много информации о сигналах и белках-акцепторах, экзогенных стимуляторах и нативных эндогенных гормонах, участвующих в морфогенезе.

 Различают прямой и непрямой пути соматического эмбриогенеза. Прямой соматический эмбриогенез заключается в формировании вегетативного зародыша из одной или нескольких клеток тканей экспланта без стадии образования промежуточного каллуса. Такое явление наблюдается у цитрусовых. У них в одном семени может развиваться до 40 зародышей. Обычно один зародыш зиготический. Он формируется от слияния половых клеток и несет признаки и отцовского и материнского организмов. Остальные зародыши – неполовые (соматические) – развиваются из клеток нуцеллуса, окружающих зародышевый мешок, и несут признаки только материнского организма. Способность к полиэмбрионии у цитрусовых используется для их клонального размножения. Нуцеллус изолируют и культивируют in vitro в условиях, в которых происходит индукция образования эмбриоидов из отдельных клеток. Непрямой соматический эмбриогенез заключается в формировании зародышей из клеток каллусной ткани или суспензионной культуры.

 В отличие от стеблевых почек соматические зародыши – это независимые двухполюсные структуры, физически не прикрепленные к ткани, из которой они происходят. Кроме того, соматические эмбриоиды в отличие от органогенеза побегов, более точно воспроизводят генотип исходного растения.

 Процесс соматического эмбриогенеза можно разделить на две стадии:

1. Начальная клеточная фаза, которая менее других изучена и наиболее важна – это первичные процессы в проэмбриогенных клетках, 59 связанные с их переходом в детерминированное состояние. Данный этап не характерен для зиготы, развивающейся из зародышевого мешка.

 2. Переход к эмбриогенезу или развитию зародыша in vitro. Этот этап включает стадии, аналогичные стадиям при зиготическом эмбриогенезе: стадии глобулы, сердца, торпедо и сформированного проростка. Морфологически такие стадии практически одинаковы in vivo и in vitro.

Факторами, индуцирующими соматический эмбриогенез, являются фитогормоны. Наиболее эффективен ауксин 2,4-Д, однако он необходим только для детерминации клеток. Развивающиеся зародыши не нуждаются в гормонах, так как начинают вырабатывать их сами. Длительное пребывание проэмбрио в среде, содержащей ауксин, приводит к пролиферации клеток, составляющих эмбриональный комплекс, и к прекращению дифференциации эмбриоидов, то есть они снова превращаются в каллусные клетки (рис. 5). Эмбриогенный каллус, пересаженный на среду без ауксина или с пониженным его содержанием, образует эмбриоиды. Эмбриоиды, перенесенные на безгормональную среду, дают проростки.

 Независимость соматического эмбриогенеза от гормонов является аргументом в пользу точки зрения о том, что сам процесс изолирования растительной клетки от организма стимулирует реализацию ее тотипотентности, т.е. переход к морфогенезу.

Заключение

Для генетических и физиологических исследований, а также для практического использования в клеточной селекции очень ценным является культивирование одиночных клеток. Так, например, вопрос о генетической неоднородности легче решать, используя клон – потомство одной клетки, а не гетерогенную ткань исходного экспланта. Для выделения одиночных клеток используют низкоагрегированные суспензии, из которых отбирают отдельные клетки. Изолирование клеток также можно производить непосредственно из тканей целого растения после их предварительной мацерации. Однако идеальный способ получения одиночных клеток заключается в использовании изолированных протопластов после восстановления ими клеточной стенки. Трудности культивирования одиночных клеток связаны с тем, что отдельная клетка не делится в тех условиях, в которых хорошо растет каллусная ткань. Для того чтобы заставить одиночные клетки делится, разработаны специальные методы. Все они основаны на использовании так называемого «кондиционирующего фактора».

Дифференцировка клеток растений in vitro может происходить различными путями и в разной степени – от дифференцировки отдельных клеток до развития целого растения. Соматический эмбриогенез – образование в каллусной ткани или суспензионной культуре эмбриоидов, т.е. зачатков интактного растения, способных развиваться во взрослое растение.

 

Список интернет-источников:

1. https://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/kultura-otdelnykh-izolirovannykh-kletok-ili-kultura-odinochnykh-kletok/
© MedBe.ru

2. http://neznaniya.net/agrojekologija/biotehnologija/454-kultura-odinochnyh-kletok.html

3. Источник: https://vseobiology.ru/kultura-kletok-i-tkanej/379-15-organogenez-v-kulture-in-vitro.

4. https://medbe.ru/materials/problemy-i-metody-biotekhnologii/organogenez-v-kulture-somaticheskikh-tkaney/
©MedBe.ru