Микроскопические исследования

Для обнаружения морфологических элементов гриба - дрожжевых клеток, псевдомицелия, мицелия, конидиеносцев, конидий, тканевых форм глубоких микозов - патологический материал исследуют в нативных и окрашенных препаратах.

Жидкий патологический материал просматривают в неокрашенном состоянии в следующих просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином (этиловый спирт 1 ч., глицерин 2 ч., дистиллированная вода 2 ч.), раствор Люголя (1 г кристаллического йода, 2 г калия йодида, 150 мл воды), а также в воде или физиологическом растворе. Для приготовления нативных препаратов на предметное стекло петлей или пипеткой наносят каплю материала, затем 1-2 капли просветляющей жидкости, накрывают покровным стеклом и микроскопируют при малом увеличении 1:80 (окуляр 10х и объектив 8х), при котором можно видеть скопления дрожжевых клеток, псевдомицелий, мицелий и другие элементы грибов. При большом увеличении 1:400, можно характеризовать отдельные клетки.

Плотный патологический материал (кожные, ногтевые чешуйки) помещают в каплю 10-20% раствора КОН, слегка подогревают над пламенем горелки (для лучшей мацерации) до появления кристалликов щелочи по периферии капли. Затем каплю накрывают покровным стеклом, слегка надавливают на него и микроскопируют, вначале под малым увеличением для нахождения чешуйки, далее при большом увеличении.

В материале из волос мантия из окружающих волос спор (эктотрикс) или внутри волоса (эндотрикс) элементы гриба обычно очень четко видны. Поражения волос, как и размеры спор, специфичны для различных видов дерматофитов. Необходима дифференциальная диагностика между структурами гриба и артефактами. Возможными источниками ложноположительных результатов являются липидные капли, пузырьки воздуха, волокна текстиля и так называемый “мозаичный гриб”. Липидные капли могут быть похожи на дрожжевые клетки – такие находки наиболее часты в плохо просветленном материале. Волокна текстиля обычно лежат отдельно от материала эпидермиса, волос или ногтя. Они крупнее, чем гифы гриба, неравномерной толщины и не содержат септ. “Мозаичный гриб” – это артефакт, полученный в процессе кристаллизации КОН при чрезмерном нагревании препаратов. В отличие от грибов, четких разделений на клетки не определяется.

Важным этапом диагностики грибковых инфекций является приготовление окрашенных препаратов. Любой патологический материал (мазковые препараты, отпечатки органов, центрифугаты и, конечно, гистологические срезы) должны пройти три основных вида обработки: 1) окраска PAS-методом для выявления истинных грибов – эумицетов; 2) окраска по методу Грама или в модификациях по Грам-Вайгерту, по Боголепову, по Браун-Бренна – для выявления сопутствующей бактериальной микробиоты, для выявления актиномицетов и нокардий; 3) окраска по методу Циль-Нильсона или модификация по методу Киньона – для выявления кислотоупорных микроорганизмов, прежде всего, для индикации и дифференцировки с микобактериями туберкулеза, для обнаружения возбудителей проказы, нокардий и спорообразующих дрожжей.

PAS-метод (Шифф-йодная кислота) предполагает выявление в стенках микроорганизмов нейтральных полисахаридов. В стенках большинства эумицетов имеется в той или иной концентрации глюкан-маннановый комплекс, за счет чего и происходит окрашивание.

Прокариоты (бактерии) оказываются РАS–отрицательными, в том числе интересующие миколога актиномицеты и нокардии. Однако при формировании актиномикотических друз образуется так называемый “цемент”, склеивающий вегетирующий актиномикотический мицелий в гранулу, который также дает РАS-положительную окраску. В связи с чем, этот метод применим и при диагностике актиномикоза.

РАS-реакция (и ее модификация) является важнейшим методом диагностики тканевых форм грибковой инфекции. Метод основан на окислении гликолиевых групп углеводов йодной или хромовой кислотой. Йодная кислота окисляет 1,2 и 1,4 гликоли в альдегиды и разъединяет связи между носящими гидроксильные группы углеродными атомами. Альдегидные группы могут быть обнаружены и при помощи альдегидного реактива Шиффа. In situ в стенках гриба происходит интенсивное окрашивание гетерополисахаридного комплекса в пурпурно-красный цвет (методика – см. приложения).

Для подавления окраски окружающих тканей применяется обработка (“контрокраска”) световым зеленым, метаниловым желтым и т.п. В этом случае выявляются только грибные клетки, что весьма полезно на стадии индикации возбудителя в тканях или в мазковых препаратах. В то же время, судить об ответной реакции организма и альтерации тканей на таких препаратах не представляется возможным. Всегда необходимо иметь параллельные препараты, окрашенные РАS-методом с докраской гематоксилином.

На практике применяется не только РАS-метод в классическом варианте, но и его различные модификации: окисление хромовой кислотой (вместо йодной) – это реакция Бауэра, окраска по Гридли, импрегнация метенаминсеребром по методу Гомори-Грокотт. Все они успешно используются для обнаружения тканевых форм грибов, и в основе их лежит один и тот же принцип (техника – см.приложение). Табл.3.

Таблица 3