In vitro значит (в пробирке, вне организма)

Генная инженерия — это метод биотехнологии, который занимается исследованиями по перестройке генотипов.

  Генная инженерия позволяет путем операций в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим.

   Сущность методов генной инженерии заключается в том, что в генотип организма встраиваются или исключаются из него отдельные гены или группы генов. В результате встраивания в генотип ранее отсутствующего гена можно заставить клетку синтезировать белки, которые ранее она не синтезировала.

Для передачи информации необходимы векторы

Вектор (в генетике) — молекула нуклеиновой кислоты, чаще всего ДНК, используемая в генетической инженерии для передачи генетического материала другой клетке.

Существующие векторы:

· Плазмиды Плазми́ды — небольшие молекулы ДНК, физически отдельные от геномных хромосом и способные реплицироваться автономно. Как правило, плазмиды встречаются у бактерий и представляют собой двухцепочечные кольцевые молекулы

· фазмиды молекулярные векторы, являющиеся искусственными гибридами между фагом и плазмидой. Фазмиды после встройки чужеродной ДНК могут в одних условиях развиваться как фаги, а в других как плазмиды.

· векторы на основе вируса SV40 Вирус SV40 — вид полиомавирусов, обнаруженный в клетках обезьян, из рода Betapolyomavirus, является типовым видом рода. Как и у других полиомавирусов, геном SV40 представлен кольцевой двуцепочечной ДНК.

векторы на основе аденовирусов Аде́новирусы (лат. Adenoviridae) — семейство ДНК-содержащих вирусов  позвоночных, лишённых липопротеиновой оболочки. Аденовирусы имеют диаметр 70—90 нм, содержат единичную двухцепочечную молекулу ДНК

· векторы на основе герпесвирусов

· векторы на основе ретровирусов

· векторы на основе аденоассоциированного вируса                                                                                            малый вирус, инфицирующий клетки человека и некоторых других приматов. Аденоассоциированный вирус, по-видимому, не вызывает заболевания у человека и, соответственно, вызывает слабый иммунный ответ.

· Аденоассоциированный вирус может инфицировать делящиеся и неделящиеся клетки и может встраивать свой геном в геном хозяина. Эти особенности делают AAV особенно привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии[4].

Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод

получения рекомбинантных, т. е. содержащих чужеродный ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочные молекулы ДНК, состоящие из нескольких тысяч пар нуклеотидов. Этот процесс состоит из нескольких этапов.

1. Рестрикция — разрезание ДНК, например, человека на фрагменты.

2. Лигирование — фрагмент с нужным геном включают в плазмиды и сшивают их.

3. Трансформация —введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки.

  Трансформированные бактерии при этом приобретают определенные свойства. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков — клон.

4. Скрининг — отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые плазмиды, несущие нужный ген человека.

Весь этот процесс называется клонированием.

    С помощью клонирования можно получить более миллиона копий любого фрагмента ДНК человека или другого организма. Если клонированный фрагмент кодирует белок, то экспериментально можно изучить механизм, регулирующий транскрипцию этого гена, а также наработать этот белок в нужном количестве.

  Кроме того, клонированный фрагмент ДНК одного организма можно ввести в клетки другого организма.

Определения.

  Генная инженерия – это искусственный перенос нужных генов от одного вида живых организмов (бактерий, животных, растений) в другой вид, часто очень отдаленный по   происхождению. (посредством операций in vitro (в пробирке, вне организма).

in vitro значит (в пробирке, вне организма).

   Цель генной инженерии в получении клеток (в первую очередь бактериальных), способных в промышленных масштабах нарабатывать некоторые “человеческие” белки; в возможности преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим (использование в селекции растений, животных).

История генной инженерии.

     Формальной датой рождения генной инженерии считают 1972 год. В этот год группа исследователей во главе с американским биохимиком  Полом Бергом, работавшим в Стэнфордском университете, что неподалеку от Сан-Франциско в Калифорнии, сообщила о создании вне организма первой рекомбинантной ДНК. Ее еще называют гибридной, т.к. она состоит из ДНК-фрагментов различных организмов.

    Первая рекомбинантная молекула ДНК состояла из фрагментов кишечной палочки (E. Coli – Escherihia coli), группы генов самой этой бактерии и полной ДНК вируса SV40, вызывающего развитие опухолей у обезьяны.

   Основные методы генной инженерии были разработаны в начале 70-х годов прошлого (XX) века.

     Их суть заключается во введении в организм нового гена. Для этого создают специальные генетические конструкции - векторы, т.е. устройство для доставки нового гена в клетку.

                    В качестве вектора используют плазмиды.

  В бактериальной клетке, кроме основной, не покидающей клетку ДНК, может содержаться несколько различных плазмид, которыми она обменивается с другими бактериями.                                               Плазмиды являются автономными генетическими элементами, редуплицирующимися в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК.

  Плазмиды несут жизненно важные для бактерии гены – гены лекарственной устойчивости к антибактериальным препаратам.        Бактерия, имеющая различные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. Поскольку плазмиды могут переходить из одной бактериальной клетки в другую, то они быстро распространяясь среди бактерий, сохраняют им жизнь. Поэтому плазмиды называют даром природы генным инженерам.

Методы генной инженерии.

Основные понятия:

• Рестриктазы – ферменты, разрезающие молекулу ДНК;

• Лигазы – ферменты, сшивающие молекулу ДНК;

• Плазмиды – внехромосомные двухцепочечные кольцевидные молекулы ДНК.

  Они легко выделяются из бактериальных клеток хозяев и в них легко встроить любые гены, которые они переносят в ДНК нового хозяина.

Направления современной биотехнологии:

• Генная инженерия

• Клеточная инженерия

• Инженерная энзимология

Наиболее распространенными методом генной инженерии является метод конструирования и переноса рекомбинантных ДНК.                                           Этот метод включает несколько этапов.

1. Создание вектора.

Этот этап состоит из двух последовательных стадий:

1. рестрикция

2. лигирование.

  Рестрикция – означает “разрезание”, “ограничение”. При помощи фермента? рестрикционной эндонуклеазы или рестриктазы, открытой в 1974 году швейцарским ученым Вернером Арбером, происходит разрезание плазмидной ДНК, образуется расщепленная плазмида с “липкими” концами? ТТАА и ААТТ. (Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной ДНК, чтобы защищаться от вирусной инфекции.) Этой же рестриктазой разрезают ДНК человека (выделенную из клетки) на множество различных фрагментов, но с одинаковыми “липкими” концами.

Поскольку используется один и тот же фермент –рестриктаза, липкие” концы плазмиды и “липкие” концы ДНК человека (чужеродный ген) будут являться комплементарными.

Эндонуклеазы рестрикции

     

Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

    В отличие от экзонуклеаз, рестриктазы расщепляют нуклеиновые кислоты не с конца молекулы, а в середине.При этом каждая рестриктаза узнаёт определённый участок ДНК длиной от четырёх пар нуклеотидов и расщепляет нуклеотидную цепь внутри участка узнавания или вне его.Защита бактериального генома от собственной рестриктазы осуществляется с помощью метилирования нуклеотидных остатков аденина и цитозина

Лигирование - “сшивание”. Фрагменты ДНК человека включают в плазмиды и их комплементарные “липкие” концы “сшивают” ферментом лигазой. Образуется рекомбинантная плазмида.

 

2. Трансформация – введение.

     Рекомбинантные плазмиды вводят в бактериальные клетки (E. Coli), обработанные специальным образом, чтобы они на короткое время стали проницаемы для макромолекул. Однако, плазмиды проникают лишь в часть обработанных клеток.

   Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определённому антибиотику. Это позволяет отделить трансформированные бактерии от нетрансформированных, так как они погибают на среде, содержащей антибиотик. Чтобы их отделить друг от друга, бактерии высевают на питательную среду так, чтобы клетки находились на расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных клеток размножается и образует колонию из ногочисленных потомков – клон.   

3. Скрининг – отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат плазмиды, несущие нужный ген человека.

    Все бактериальные колонии покрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нём остаётся отпечаток колоний. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченым зондом.

   Зонд – это полинуклеотид, комплементарный части искомого гена (Р³²). Он гибридизируется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые имеют нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую плёнку и через несколько часов её проявляют. Засвечиваются те участки на плёнке, где располагаются клоны трансформированных бактерий с нужным геном. Их отбирают, размножают (клонируют), так как они способны вырабатывать белок, кодируемый этим геном.

Генно-модифицированный организм (ГМО) - организм, полученный с применением методов генной инженерии и содержащий гены, их фрагменты или комбинации генов других организмов.

Трансгенные организмы - животные, растения, микроорганизмы, вирусы, геном которых изменен.

 Скрестили японцы арбуз с блохой. Разрезаешь арбуз, а из него семечки выпрыгивают”. Когда-то этот анекдот казался очень смешным. Кто бы мог предположить, что он может стать реальностью!

4. Синтез гена искусственным путём.

   Не всегда удаётся вырезать точный ген с помощью рестриктаз. Многие гены расщепляются этими ферментами на несколько частей, некоторые не содержат последовательностей, узнаваемых рестриктазами. Тогда поступают другим образом. Самостоятельная работа с текстом учебника. Прочитайте текст стр. 102 – 103 со слов “Поэтому в ряде случаев…” до слов “ С помощью клонирования….” и ответьте на вопрос: “Как получить клон с нужным в данном случае геном?”

Домашнее задание.  

1.Ответить на вопросы:

-Что такое генная инженерия?

- Что такое клонирование

- Как называется рассмотренный нами метод генной инженерии?

- Из каких этапов он состоит?

- Что такое вектор?

- Сколько стадий включает этап создания вектора?

- Опишите эти стадии.

- Что такое трансформация?

- Что такое скрининг?

- Опишите скрининг.

2. Дать определение терминам:

а.) ген;

б.) геном;

в.) локус;

Г) хромосома.