2020-10-10
257
Чтобы вставить ген млекопитающего в прокариотическую клетку, должны быть выполнены два основных требования.
Во-первых, исследователи должны выделить нужный ген из целого генома.
Во-вторых, исследователи должны найти способ гарантировать, что прокариотическая клетка может правильно экспрессировать ген млекопитающих.
Создание и выделение гена для клонирования
Эукариотическая хромосома и отобранные бактериальные плазмиды, которые должны использоваться в качестве вектора, обрабатываются рестрикционной эндонуклеазой.
Когда эукариотические фрагменты ДНК соединяются с разорванными плазмидами, некоторые из плазмид рекомбинируют с эукариотической ДНК.
Затем плазмиды возвращаются бактериям-хозяевам путем культивирования в растворе таким образом, что некоторые из бактерий поглощают плазмиды.
Однако многие плазмиды не содержат рекомбинантную ДНК, а из тех, которые содержат, только небольшая часть имеет в своем составе нужный (целевой) ген млекопитающих. Поэтому следующим шагом является выделение бактериальных колоний, содержащих рекомбинантные плазмиды с необходимым геном.
Нуклеазы, используемые в генной инженерии
Нуклеазы –это большая группа ферментов, катализирующих реакцию гидролиза молекул нуклеиновых кислот. В результате действия нуклеаз молекула ДНК или РНК распадается на фрагменты или отдельные нуклеотиды. Исходная функция нуклеаз в клетке – деградация ненужных в данный момент жизнедеятельности молекул и защита от чужеродных молекул нуклеиновых кислот. Нуклеазы избирательно могут действовать на одноцепочечную (нуклеаза S1), или двуцепочечную (экзонуклеаза III) молекулы ДНК, или на гибридную ДНК – РНК-молекулу (рибонуклеаза Н). Два типа нуклеаз: экзо- и эндонуклеазы. Экзонуклеазы обычно гидролизуют молекулы с 5 ́- или 3 ́- свободных концов, а эндонуклеазы могут расщеплять внутри последовательности фрагмента или кольцевой молекулы ДНК.
Рестриктазы, характеристика
Рестриктазы. Представляют собой особый класс эндонуклеаз, которые гидролизуют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называются сайтами рестрикци. Каждая из рестриктаз узнает свой свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри последовательности сайта рестрикции, либо в непосредственной близости от него. При действии конкретной рестриктазы одна и та же последовательность ДНК будет всегда образовывать одинаковый набор фрагментов.
последовательности. Рестриктазы I типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии от сайта узнавания. Такие рестриктазы невозможно использовать для решения генно-инженерных задач. Рестриктазы III типа похожи на рестриктазы I типа, они гидролизуют ДНК на на расстоянии 20 – 35 н.п. от сайтов узнавания и также довольно редко используются в практических целях.
Ферменты, используемые для получения рекомбинантных молекул, - рестриктазы II типа. Основной характеристикой таких рестриктаз является то, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают. Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены симметричными при повороте на 180 градусов последовательностями –палиндромами.
Рестриктазы II типа делятся на несколько классов в зависимости от раразмера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК:
1) мелкощепящие – сайт рестрикции которых представлен четырьмя нуклеотидными парами;
2) среднещепящие – сайт рестрикции – 6 – 8 н.п.;
3) крупнощепящие – сайт рестрикции – 10 – 14 н.п.
Рестриктазы являются основными ферментами, используемыми в генетической инженерии.
Лигазы, характеристика
Иными словами, ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репарации ДНК, в процессах репликации - при удвоении цепи ДНК.
Лигазы катализируют образование органических соединений из активированных нуклеозидтрифосфатами исходных веществ.
В генной инженерии используются 2 типа ДНК-лигаз, отличающихся по потребностям в кофакторах и способу действия. ДНК-лигаза E. coli в качестве кофактора использует дифосфопиридиннуклеотид, а лигаза фага Т4 - АТФ в присутствии Mg2+. Лигаза фага Т4 более универсальна, так как помимо лигирования липких концов способна катализировать реакцию воссоединения двухцепочечных фрагментов ДНК с тупыми концами. Она используется чаще.
Векторная молекула, характеристика
Вектор – обязательная генетическая конструкция, используемая в опытах по генной инженерии. Вектором (лат. – переносчик, носитель) в ГИ называют молекулу ДНК, способную самостоятельно реплицироваться, включать чужеродную ДНК, переносить ее в реципиентные клетки и стабильно там поддерживать. Векторы используют для создания in vitro молекул рекДНК и для последующего введения их в клетки, в составе которых они клонируют число чужеродных генов.
