А. Фракционирование клеток

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ МОЛЕКУЛ

Клетки значительно отличаются друг от друга. Некоторые специализированные клетки накапливают в большом количестве триацилглицериды или углеводы. Железистые клетки часто характеризуются необычно высоким содержанием белка и РНК. Простой приближенный анализ состава ткани проводят следующим образом. Ткань полностью высушивают в вакууме при низкой температуре (лиофилизация) и из полученного твердого материала соответствующими растворителями экстрагируют липиды. После выпаривания растворителя взвешивают оставшиеся липиды. Содержание белка часто оценивают по содержанию азота, умножив его количество на 6,25 (так как процентное содержание азота в белке достаточно стабильная величина и равна 16%, то есть 100:16=6,25). Мерой содержания в ткани неорганических компонентов служит вес золы, образовавшейся после сжигания образца ткани при высокой температуре. В рамках такого приближенного анализа содержание углеводов оценивается вычитанием всего остального из 100%.

В современной биохимии важное место занимает разделение соединений, анализ смесей и установление структуры молекул. Стадии изучения структур молекул:

1. Выделение.

Исходным материалом при фракционировании может служить свежая ткань (растительная или животная) или осадок спрессованных клеток микроорганизма, обычно получаемый с помощью центрифугирования.

Ткань измельчают. Легче всего разрушаются клетки животных, сложнее клетки растений, обладающие клеточной стенкой, еще проблематичнее разрушить микробные клетки. Чтобы избежать денатурации белка в процессе его выделения, все операции проводят в мягких условиях – при низкой температуре (не выше 5^оС), избегая действия разных химических агентов. Животные клетки разрушают гомогенизаторами. Клеточные стенки растений и микроорганизмов разрушают мельницами, специальными гомогенизаторами, путем продавливания через фильтры специального пресса, методом попеременного замораживания и оттаивания, ультразвуком. Также используют метод «азотной бомбы», который заключается в насыщении суспендированных клеток газообразным азотом под высоким давлением, которое затем резко сбрасывают, – азот, проникший внутрь клеток, выделяется в виде газа и взрывает их. При фракционировании очень важно подобрать значение рН и состав буфера, а при выделении субклеточных органелл – осмотическое давление. Для сохранения целостности органелл часто в качестве среды используют 0,25 М сахарозу, к которой добавляют MgCl₂, а также реагент, образующий комплекс с металлами, например этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). Растворимые ферменты обычно экстрагируют без добавления сахарозы, но при этом используют восстановители – глутатион, меркаптоэтанол или дитиотреитол.

Полученный сырой гомогенат процеживают и обычно центрифугируют непродолжительное время, чтобы удалить фрагменты клеток. Клеточные органеллы, как правило, отделяют центрифугированием. Одна из методик состоит в следующем. Гомогенат в 0,25 М сахарозе (изотоничной по отношению к большей части клеток) центрифугируют в течение 10 мин при 600-1000 g, что позволяет осадить ядра и целые клетки. Затем надосадочную жидкость центрифугируют еще 10 мин при 10 000 g, в результате чего осаждаются митохондрии и лизосомы. Наконец, центрифугирование в течение часа при 100 000 g дает микросомный осадок. Супернатант (надосадочная жидкость), остающийся после центрифугирования с максимальной скоростью, служит исходным материалом для выделения растворимых ферментов и многих низкомолекулярных соединений.

Для выделения интактных органелл среда должна быть изотоничной, в гипотоничной среде органеллы будут впитывать воду и лопнут, а в гипертонических растворах они сморщатся. Выделение органелл проводят при низких температурах (0-5⁰С) для того, чтобы уменьшить степень деградации материала за счет реакций, катализируемых ферментами, которые высвобождаются в процессе разрушения тканей. Часто добавляют тиолы и хелатирующие агенты для защиты функциональных SH-групп от окисления.