Гидролиз

Е. Разделение, основанное на электрическом заряде молекул.

В основе ряда методов разделения молекул лежит различие в суммарном заряде, который они несут при данном рН среды. Этот суммарный заряд для многих соединений легко оценить по числу содержащихся в них кислых и основных групп.

Электрофорез – процесс разделения молекул, основанный на разной скорости перемещения их в электрическом поле Скорость передвижения молекул определенного вида к катоду или аноду зависит от электрического заряда, молекулярной массы и формы молекулы, ионной силы, рН и состава буферного раствора, а также приложенных потенциалов. Наибольшее распространение получил электрофорез на твердых средах: целлюлозе, ацетилцеллюлозе, агарозе, крахмальном и полиакриламидном геле. Очень небольшое количество раствора, содержащего смесь белков, наносят в виде тонкой полоски на носитель. Лист насыщают буфером и пропускают через него электрический ток. Напряжение устанавливают обычно в несколько сот вольт. Для ускорения процесса и снижения диффузии низкомолекулярных веществ широко используют высоковольтный электрофорез. Прикладываемое напряжение составляет в этом случае 2-3 тыс.вольт. Образец постоянно охлаждают с помощью термостатируемых пластин; иногда для той же цели всю систему погружают в сосуд с керосином. Электрофоретическое разделение больших количеств материала проводится в плоских лотках, заполненных крахмальным или каким-либо другим гелем. Одним из наиболее распространенных и чувствительных методов разделения белков является электрофорез в колонке, заполненной полиакриламидным гелем. Этот метод позволяет проводить разделение молекул одновременно и по размеру, и по электрическому заряду; его называют методом электрофоретического молекулярного сита.

При изоэлектрическом фокусировании в вертикальной колонке между катодом и анодом электрохимически создается градиент рН. Градиент рН стабилизируется градиентом плотности, чаще всего сахарозным; вся система тщательно термостатируется. Белки в колонке движутся в направлении, соответствующем их изоэлектрической точке, где фокусируются в виде очень узкой полосы. Две соседние полосы могут быть разделены интервалом всего лишь в 0,01 единицы рН. Считается, что изоэлектрические точки белков в обычных экспериментальных условиях близки к их изоионным точкам, то есть к тем значениям рН, при которых белки остаются изоэлектрическими в условиях полного отсутствия добавленного электролита.

Важным методом разделения молекул является ионообменная хроматография. Метод основан на электростатическом взаимодействии между ионами противоположного заряда. Главное условие при этом, чтобы ионы одного заряда были ковалентно фиксированы на онертном носителе. Такой ионообменник будет связывать ионы противоположного заряда. Обычно применяются водные растворы смесей и колонки, наполненные ионообменной смолой – пористым веществом, содержащим связанны ионные группы, например –SO₃^-, -COO^-, -NH₃⁺, или четвертичные атомы азота. Для разделения малых молекул берут синтетические смолы, основу которых составляет полистирол с поперечными сшивками. Для крупных молекул больше подходят производные целлюлозы или поперечносшитых декстранов (сефадекс). При промывании ионообменника раствором с более высокой ионной силой или иным значением рН сорбированные ионы можно селективно перевести в раствор (элюировать).

При разделении аминокислот методом ионообменной хроматографии в качестве неподвижной фазы используются гранулы синтетического полимера, несущие сульфогруппы –SO₃^-. Эти группы ионизированы во всем диапазоне рН и несут отрицательный заряд. Для подготовки к работе ионообменник помещают в колонку и промывают Na⁺-содержащим буферным раствором с рН 2. При этом сульфогруппа связывает ионы натрия. Если теперь нанести на колонку раствор аминокислот, то положительно заряженные аминокислоты вытеснят ионы натрия и будут сорбироваться на ионите. Поскольку аминокислоты не несут заряда в изоэлектрической точке, их элюируют с колонки буфером с более высоким значением рН. Из колонки разделенные аминокислоты направляются в смеситель, куда подается раствор нингидрина, далее окрашенный раствор подается в ФЭК, связанный с самописцем, на ленте которого плотность окраски записывается в виде пиков, высота и ширина их соответствуют содержанию аминокислоты в растворе. Все перечисленные устройства образуют прибор, получивший название автоматического анализатора аминокислот.

Почти все биополимеры по своей природе нестабильны и могут гидролизоваться под действием протонов, ионов гидроксила и ферментов.

Полный гидролиз белков обычно проводят путем нагревания при температуре около 110⁰ в атмосфере N₂ в присутствии 6 н.НСl в течение 12-96 часов. При кислотном гидролизе полностью разрушается триптофан, цистин и частично цистеин. Полный гидролиз белков можно осуществить с помощью оснóвных катализаторов, но при этом наблюдается значительная рацемизация аминокислот. В присутствии металлов при гидролизе частично теряется метионин и тирозин. При любом гидролизе глутамин и аспарагин дезаминируются в глутамат и аспартат, содержание серина и треонина бывает заниженным. Некоторые связи (вал-вал, иле-иле, вал-иле, иле-вал) даже через 20 часов гидролизуются только на 50%. После полного гидролиза методом ионообменной хроматографии можно определить содержание каждой аминокислоты, входящей в состав анализируемого белка.

Нуклеиновые кислоты тоже гидролизуют сильной кислотой. Например, нагревания в течение 1 часа при 100⁰С в 12 н. хлорной кислоте достаточно для расщепления молекулы до составляющих ее оснований. В ДНК N-гликозидные связи более лабильны, чем в РНК, связи с пуринами более лабильны, чем с пиримидинами. Последнее обстоятельство позволяет провести весьма полезную операцию: если оставить ДНК на ночь на холоду при рН 2, произойдет полная ее апуринизация.

Щелочной гидролиз РНК дает смесь 2’- и 3’-нуклеотидов. Механизм этого процесса связан с участием свободных 2’-ОН-групп рибозы и образованием циклических 2’,3’-фосфатов. Поскольку у ДНК нет свободной 2’-ОН-группы, ДНК в щелочной среде не разрушается.

Ферментативные методы гидролиза особенно ценны благодаря присущей им во многих случаях специфичности. Трипсин быстро расщепляет пептидные связи по карбоксильным группам лизина и аргинина. Трипсин расщепляет только денатурированные белки с разорванными дисульфидными мостиками. Пепсин и химотрипсин расщепляют пептидные связи по карбоксильным группам ароматических аминокислот.

Для того чтобы выстроить пептиды в том порядке, в котором они расположены в нативном белке, используют метод пептидных карт. Его первый этап состоит в разрыве дисульфидных связей, далее белок денатурируют и расщепляют ферментами, например трипсином или пепсином. В результате получается набор пептидов, размер и аминокислотный состав которых характерен для каждого отдельного белка. Смесь пептидов наносят на лист хроматографической бумаги и проводят в одном направлении хроматографию, а в другом – электрофорез. Пептиды локализуются в виде отдельных пятен, образуя характерную картину. Метод пептидных карт особенно полезен для выявления малых различий в структуре белка, например различий между генетическими разновидностями одного и того же белка.

Некоторые ферменты катализируют последовательное отщепление аминокислот с одного или другого конца петидной цепи. Карбоксипептидазы отщепляют аминокислоты с карбоксильного конца, а аминопептидазы – с аминного конца. Используя хроматографию, можно определить последовательность отщепления аминокислот.

Полный ферментативный гидролиз белков проводят с помощью ферментов из грибов. Однако эти ферменты расщепляют еще и друг друга, поэтому сейчас их иммобилизируют на колонках с агаровым гелем. Белок пропускают через этот гель, после чего на дне колонки скапливаются составляющие его аминокислоты.

Методы определения нуклеотидных последовательностей ДНК разрабатывались медленнее. Экзонуклеазы отщепляют нуклеотиды с концов полинуклеотидных цепочек. Для отщепления нуклеотидов с 5’-конца используют фосфодиэстеразу из селезенки быка, с 3’-конца – неспецифическую диэстеразу змеиного яда. Эндонуклеазы делают разрывы внутри цепи. Одни из них гидролизуют только одноцепочечные молекулы, другие – двухцепочечные. Некоторые нуклеазы разрывают обе цепи ДНК, тогда как другие вносят разрыв только в одну из цепей. Используют панкреатическую дезоксирибонуклеазу I и II, микрококковую ДНКазу, панкреатическую рибонуклеазу, расщепляющую цепь только справа (ниже) от пиримидинсодержащих нуклеотидов, рибонуклеазу Т1 из Aspergillus oryzae, расщепляющую связи справа от гуанидинсодержащих остатков, рибонуклеазу Т2 из Aspergillus oryzae, расщепляющую цепь справа от аденинсодержащих остатков. Полученные фрагменты далее анализируют электрофорезом или хроматографией и по смещению одного пятна относительно другого определяют примерную нуклеотидную последовательность.

Существует целая группа специфических ферментов, расщепляющих полисахариды. α-Амилазы из слюны и поджелудочной железы разрывают молекулы крахмала случайным образом, а растительные β-амилазы последовательно отщепляют мальтозу с концов неразветвленных цепей.

Сложные липиды расщепляются липазами. Панкреатическая липаза удаляет 1- и 3-ацильные группы триацилглицеридов с образованием 2-моноацилглицеридов. Фосфолипаза А₂, присутствующая в различных тканях и бактериях, а также входящая в состав змеиного яда, избирательно отщепляет от фосфолипидов ацильную группу, стоящую во 2-м положении. В бактериях и растительных тканях присутствуют фосфодиэстеразы, известные под названием фосфолипаз C и D, которые разрывают цепь по левую и правую стороны от фосфодиэфирной связи. Для неизбирательного расщепления эфирных связей используют мягкий гидролиз в присутствии оснóвных катализаторов. Получающиеся фосфодиэфиры, амиды и эфиры можно разделить и идентифицировать.