В настоящее время существует два основных способа переноса генетических конструкций в геном высших растений. Один из них основан на природной способности почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens переносить часть своей ДНК в растительный геном. Второй подход заключается в непосредственном переносе экзогенной ДНК в растительную клетку (при помощи генной пушки, методом электропорации протопластов, микроинъекций и т.д.).
Наиболее распространенным методом прямого переноса ДНК является бомбардировка растительных тканей микрочастицами металлов (биобаллистика). Этот метод впервые был использован для получения трансгенных растений в 1987 году. Метод заключается в обстреливании клеток растений микрочастицами (диаметр 0,5—1 мкм) вольфрама или золота с адсорбированными на их поверхности молекулами ДНК. Для этих целей необходимо использование специального оборудования — генной пушки. В качестве объекта для бомбардировки применяют, как правило, каллусы или тканевые экспланты (меристемы).
|
|
Электропорация протопластов. Основным условием для широкого применения методов прямой трансформации протопластов является наличие надежных, хорошо разработанных систем регенерации полноценных растений в культуре in vitro. При использовании этого метода фрагменты экзогенной ДНК поступают в протопласты (растительные клетки, лишенные целлюлозных оболочек) через поры в липидной оболочке, образованные действием короткого электрического импульса. Образование таких пор обратимо при условии, что сила приложенного электрического поля не превышает некоторого порогового значения. В противном случае, наступает массовая гибель клеток.
Использование полиэтиленгликоля (ПЭГ) для трансформации протопластов основано на его способности стимулировать в присутствии двухвалентных катионов преципитацию ДНК на поверхности мембраны с последующим поглощением фрагментов экзогенной ДНК посредством эндоцитоза.
Использование карбида кремния для трансформации клеток растений, каллусов и растительных эксплантов является очень простым и дешевым методом. Данный метод состоит в интенсивном совместном перемешивании (на шейкере) кристаллов карбида кальция с растительным материалом и фрагментами экзогенной ДНК, предназначенной для введения в клетки. При перемешивании кристаллы карбида кремния прокалывают целлюлозные оболочки, благодаря чему ДНК проникает в клетки и может интегрироваться в растительный геном. Основной недостаток данного метода состоит в низкой эффективности, обусловленной гибелью клеток при поранении.
Бактерии рода Agrobacterium – это почвенные бактерии, отдельные штаммы которых являются патогенными для растений и трансформируют их клетки. Круг растений-хозяев для патогенов рода Agrobacterium достаточно широк — более 600 видов двудольных, несколько видов однодольных и около 40 видов голосеменных растений. Почвенная бактерия A.tumefaciens способна вызывать в местах поранения у двудольных растений опухолевый рост зараженных клеток. Патогенные свойства почвенной бактерии A. tumefaciens связаны с наличием большой (около 200 т.п.н.) Ti (t umor i nducing)–плазмиды. Геном A. tumefaciens представлен одной хромосомой и множеством (200—250) кольцевых фрагментов ДНК (плазмид), разного размера. Плазмиды большого размера (200—250т.п.н.) получили название мегаплазмид, среди которых Ti-плазмида выполняет роль ин-фицирующего фактора заболевания «корончатые галлы».
|
|
Основными составными частями Ti-плазмиды являются область Т-ДНК, гены катаболизма ферментов, vir-область и сайт инициации репликации в A.tumefaciens. Часть плазмиды, способная переноситься в растительную клетку и встраиваться в ядерный геном, получила специальное название - Т-ДНК (от английского transferred DNA). Остальная часть плазмиды, не принадлежащая к Т-ДНК, называется векторной ДНК.
Фрагмент Т-ДНК фланкирован прямыми повторами длиной 25 п.н. (правая и левая пограничные последовательности) и содержит гены двух типов: онкогены, кодирующие ферменты биосинтеза ростовых факторов растения (ауксинов и цитокининов), и ген синтеза опинов. Опухолевый рост инфицированных клеток, вызванный экспрессией ростовых факторов, создает экологическую нишу, а секретируемые опины служат источником углерода и азота для агробактерий. Помимо Т-ДНК Ti-плазмида содержит гены катаболизма опинов и гены вирулентности, необходимые для ее переноса в растительную клетку и стабильной интеграции в ядерный геном. В процессе агробактериального заражения фрагмент Ti-плазмиды (Т-ДНК) переносится в растительную клетку и интегрируется с ядерным геномом. Перенос осуществляется координированным действием генов (как правило, представленными шестью оперонами), расположенными в vir-области мегаплазмиды. На основе Ti-плазмиды A.tumefaciens была сконструирована серия так называемых «обезоруженных» (не содержащих онкогены) векторов, что положило начало прикладной генетической инженерии.