Физиологические основы криосохранения

Замедление роста

Замедления роста можно добиться следующими методами:

1. Хранение под слоем минерального масла (для бактериальных и грибных культур).

2. Изменение газового состава и атмосферного давления внутри культурального сосуда.

3. Изменение светового режима.

4. Охлаждение до температуры прекращения активного роста.

5. Применение гормональных и осмотических ингибиторов. Из гормональных ингибиторов наиболее часто используют хлорхолинхлорид (для растительных клеток), из осмотических - маннит в концентрации 3-6%.

6. Замена СaCl₂ на Ca(NO₃)₂ в питательных средах.

Для картофеля в качестве способа, позволяющего сохранить генофонд, рекомендуется клубнеобразование в пробирках.

Проблема хранения генофонда растений и их клеточных штаммов стала, в сущности, проблемой криосохранения семян, апексов побегов, эмбрионов и клеток in vitro. Апексы in vitro регенерируют исходный генотип и обеспечивают сохранение не только сортов, форм и видов, вегетативно размножающихся и других растений, но и клонирование отдельных элитных экземпляров.

Таким образом, криосохранение – единственный способ длительного хранения клеточных штаммов, тканей и микроорганизмов.

Термин «криосохранение» (cryopreservation) употребляется для обозначения сложного многоэтапного процесса, который проводится с целью неограниченно долгого сохранениия стабильными живые клетки, ткани и органы в состоянии анабиоза.

Холодовой анабиоз индуцируется в клетках гипотермией и замораживанием до низких температур. Только в состоянии глубокого анабиоза, когда полностью останавливаются обменные, биохимические реакции и отсутствует жидкая фаза, создаются условия для длительного хранения биологической системы с последующим полным возвратом ее к исходному состоянию в условиях нормотермии. Самое главное - это сохранить жизнеспособность клеток, их свойства, а также способность к морфогенезу и регенерации целых растений после воздействия сверхнизких температур.

Единственно надежным средством для решения этой задачи является глубокий холод (-140^оС и ниже), обеспечиваемый наиболее практично с помощью жидкого азота (-196 ^о С).

Таким образом, исследования в области криобиологии направлены на решение фундаментальной проблемы биологии, а именно – перевод биологической системы в состояние искусственного глубокого холодового анабиоза с целью продолжительного хранения с последующим возобновлением роста после оттаивания.

Важнейший этап процесса криосохранения – замораживание. На этом этапе возникают трудности, так как существуют 2 группы объектов, подвергаемых криосохранению.

Первая группа – это ткани, содержание воды в которых минимально (пыльца, семена). Для таких объектов этот процесс достаточно прост. Их можно прямо погружать в жидкий азот и оттаивать впоследствии на воздухе в обычных условиях.

Вторая группа – это большинство растительных тканей. Для них характерны большие размеры клеток, прочная целлюлозная стенка и наличие центральной вакуоли. Причем именно степень вакуолизации клетки (оводненность) играет основную роль в устойчивости к действию низких температур. У таких объектов прием простого замораживания малоэффективен, так как не происходит сохранение всех исходных свойств и жизнеспособности.

Один из повреждающих факторов при замораживании – лед, возникающий сначала в растворе вокруг клеток, а другой – дегидратация клеток, вызываемая ростом кристаллов этого внеклеточного льда.

Первая задача криосохранения – предотвратить образование кристаллов льда внутри клеток. В случае клеток растений эта задача решается труднее, чем для других объектов, вследствие обилия в них свободной воды. Эту трудность можно преодолеть снижением скорости охлаждения или предварительным обезвоживанием клеток. Известно, чем больше воды в клетке, тем меньше должна быть скорость замораживания.

Вторая задача криосохранения – ослабить группу стрессовых воздействий, вызванных неизбежной дегидратацией (денатурация белков, нарушение функционирования мембран, увеличение концентрации ионов до токсических величин, нарушение синтеза нормальных клеточных белков). Чтобы ослабить их действие, необходимы и оптимальный состав смеси протекторов, и оптимальная скорость замораживания, и более того – оптимизация всей программы процесса криосохранения.

В связи с этим возникла необходимость проведения планомерных фундаментальных и прикладных исследований по выяснению механизмов криоповреждений и криозащиты биологических систем разных уровней организации.

Предотвращение внутриклеточного образования льда.

Клетка погибает при образовании льда в протопласте. Безопасны для структур клетки кристаллы размером не более 0,1 мкм.

При медленном замораживании (в парах жидкого азота или в специальных программных замораживателях) лед образуется в первую очередь в межклетниках. Лед формирует градиент водного потенциала, направленный из клеток в межклетники. Это постепенно приводит к дегидратации клеток и, как следствие, организм успевает приспособиться к низким температурам.

Таким образом, постепенная дегидратация протопласта является одним из необходимых условий выживания клеток при замораживании.

Биологические антифризы.

В клетках некоторых растений синтезируются высокомолекулярные соединения, тормозящие процессы роста кристаллов льда. Эти соединения получили название биологических антифризов. Антифризы можно выделить экстракцией из межклеточного пространства. Сведения об антифризной активности внутри клеток отсутствуют, поэтому считается, что они препятствуют внеклеточному образованию льда, особенно в тех органах и тканях, чьи клетки должны сохранить максимальное количество воды и находиться в переохлажденном состоянии (почки и меристемы).

Известны антифризы белковой, гликопротеиновой и полисахаридной природы. Считается, что действие антифризов основано на наличии в их молекулах большого числа полярных группировок. Таким образом, возможно, с помощью антифризов осуществляется блокада роста кристаллов льда.