Выделение и идентификация культур бруцелл

Окраска бруцелл по Шуляку-Шин. Мазок фиксируют на пламени, окрашивают 2 минуты карболовым фук­сином Циля, разведенным водой 1:5, промывают водой, окрашивают 5 минут 2%-ным водным раствором метиленового синего, промывают водой. Микроскопическая картина: бруцеллы — красные, другие бактерии име­ют синий цвет.

Окраска бруцелл по Кюстеру. Препарат фиксируют на пламени, окрашивают 60 секунд щелочным ра­створом сафранина, промывают водой, обрабатывают 15 секунд 0,05%-ным раствором серной кислоты, тщательно промывают водой, окрашивают 15-20 секунд 3%-ным водным раствором метиленового синего. Микроскопичес­кая картина: бруцеллы — красные, другие бактерии синего цвета.

Микроскопическое исследование исходного материала

Из поступившего материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и одним из специальных методов (по Козловскому, Стампу и т.д.), а также бруцеллезными люминесцирующими сыворотками.

В препаратах, окрашенных по методу Грама, бруцеллы имеют форму мел­ких, коротких, коккоподобных или палочковидных грамотрицательных бак­терий, размером 0,5-0,7х0,6-1,5 мкм, истинной капсулы не образуют, рас­положены одиночно, реже — парами, короткими цепочками или небольши­ми группами.

Для бруцелл характерно более медленное окрашивание и отдача краси­теля при промывании водой или обработке слабыми растворами кислот по сравнению с другими видами бактерий, что позволило ряду авторов предло­жить дифференциальные методы окраски клеток возбудителя.

Окраска бруцелл по Е.В. Козловскому. Мазок фиксируют на пламени, окрашивают 2%-ным водным раствором сафранина 2 минуты с подогреванием до появления пузырьков, затем про­мывают водой и докрашивают 0,75-1%-ным водным раствором брилли­антовой или малахитовой зелени (или метиленового синего) в течение 1-2 минут, споласкивают водой. Микроскопическая картина: бруцеллы — ярко-красные, другие бактерии — зеленого или синего цвета.

Окраска бруцелл по Стампу (модифицированный метод Циля- Нильсена). Мазок фиксируют на пламени, окрашивают фуксином Пфейффера в те­чение 10 минут, промывают водой, обрабатывают
30 секунд 0,5%-ным вод­ным раствором уксусной кислоты, промывают водой, окрашивают 20-30 секунд 1%-ным водным раствором метиленового синего, промывают во­дой. Микроскопическая картина: бруцеллы — красные, прочие бактерии имеют синий цвет.

Приготовление щелочного раствора сафранина (ex tempore). Смешивают 5 капель 3%-ного водного раствора сафранина и 1,5 мл нормального раствора КОН (5,6 г на 100 мл воды).

Иммунолюминесцентное выявление бруцелл проводят прямым или не­прямым способом.

Культивирование. Обычно исследуемый материал засевают в пробирку с жидкой и в не­сколько пробирок (5-10) — с агаровой питательной средой (мясо-пептонный печеночный бульон, мясо-пептонный-печеночно-глюкозный-глицериновый бульон, альбими-бульон, аналогичные агаровые среды, сывороточнокартофельный агар, сывороточно-декстрозный агар). Бруцеллы хоро­шо растут на кровяном агаре (5-10%). Загрязненный материал высевают на сывороточно-декстрозный агар с ингибиторами (рекомендация Объеди­ненного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу): генцианвиолет 1:200 тыс. или кристаллический фиолетовый 1:100 тыс., уксуснокислый натрий (0,25 мг/мл) или паранитрофенилглицерин (0,005-0,007%).

Бруцеллы — аэробы или микроаэрофилы. Температурный оптимум 37°С, диапазон - 20-40°С, оптимум рН 6,6-7,4. Микроаэрофильные свойства проявляют В. abortus и В. ovis. Поскольку не известно, какой вид бруцелл присут­ствует в исследуемом материале от крупного рогатого скота, то половину пробирок с посевами инкубируют в условиях обычной атмосферы, вторую — в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (10-12%). Посевы при исследовании на наличие В. ovis инкубируют только в атмос­фере СО₂. В первой генерации бруцеллы обладают замедленным ростом, по­этому посевы культивируют, периодически просматривая, до 30 дней. Подготовка и исследование различных материалов имеют некоторые особенности.

При исследовании абортированного плода производят посев тканевого гомогената или пастеровскими пипетками непосредственно из органов. Посевы делают из экссудата грудной и брюшной полостей, содержимого желудка, крови сердца, печени, селезенки, легких. При посеве из паренхи­матозных органов выбирают участки с фокусами некрозов, кровоизлияни­ями.

Для изготовления тканевого гомогената кусочки паренхиматозных ор­ганов обжигают, растирают в ступке со стерильным кварцевым песком и физиологическим раствором (1:10), гомогенат высевают на среды. Анало­гичным образом подготавливают для посева материал, взятый при диагно­стическом убое животных.

При осмотре плаценты отбирают участки с утолщенными ворсинками и стенками, с наличием гнойного экссудата. Поверхность плаценты обраба­тывают тампонами с дезинфектантами, просушивают стерильными тампо­нами, прижигают выбранный участок, вырезают необходимые фрагменты, измельчают, как было описано выше, и высевают на среды с ингибитора­ми.

Порции молока из каждой четверти вымени центрифугируют при 1000-3000 об/мин в течение 10-20 минут. Посев производят из осадка и слоя сливок на селективные среды. Рекомендуется исследовать пробы молока, взятые от животного несколько раз с интервалом 5-10 суток.

Мочу (75-100 мл) перед посевом на питательные среды центрифугиру­ют при 3000 об/мин в течение 10 минут и осадок высевают на селективные среды. Возможна концентрация бруцелл путем добавления к моче бруцеллез­ной агглютинирующей сыворотки (1-2%) с титром не менее 1:800. После непродолжительного инкубирования мочу центрифугируют и осадок высе­вают на питательные среды.

Эффективен посев в жировые куриные яйца при исследовании крови, мочи и других материалов, содержащих малое количество возбудителя. Исполь­зуют свежие куриные яйца (3-5 дней). На каждый материал берут 3-5 яиц. Исследуемый материал в количестве 0,2 мл вводят в желточный мешок, ин­кубируют при 37° С в течение пяти суток, вскрывают, набирают пастеровс­кими пипетками белок и желток и высевают на плотные и жидкие питатель­ные среды (методика Одесского ИМ имени И.И. Мечникова).

Кровь высевают сразу после взятия в жидкие питательные среды с антикоагулянтом (2%-ный цитрат натрия). В 100 мл среды засевают около 20 мл крови. В качестве питательной среды используют бульон Альбими, триптозный бульон, среду Первушина, МПБ с 1% глюкозы и 2-3% глицерина. Хо­рошие результаты получаются при посеве на комбинированные среды (ме­тод Кастанеда). Например, в колбе (пробирке) скашивают агар (ППГГА), добавляют какую-либо жидкую питательную среду, чтобы она покрывала половину поверхности агара, и в нее засевают кровь (П.А. Триленко 1976). Через 4-6 дней культивирования поверхность агара увлажняют жидкой средой и в последующем периодически просматривают с целью обнаружения колоний бруцелл.

Характер роста бруцелл на питательных средах. Колонии бруцелл появляются на поверхности плотных питательных сред на 5-10-е, реже — на 20-25-е сутки. В первичных посевах формируются, как правило, колонии S-формы: бесцветные, круглые, выпуклые, с ровными краями, гладкой маслянистой поверхностью, полупрозрачные, диаметр коло­ний в зависимости от типа питательной среды от 0,1-0,7 до 2,0-2,5 мм и более. По мере старения колонии теряют прозрачность, мутнеют и темнеют за с 1ст появления пигмента. На ППГГА в проходящем свете колонии имеют ян-гарный оттенок.

При изучении колоний в косопроходящем пучке света они имеют зеленовато-серо-голубой цвет с неболь­шим красновато-желтым центром.

При исследовании материала от животных с хроническим течением бру­целлеза могут быть выделены бруцеллы в R-форме, отличающиеся не толь­ко по форме, но особенно по характеру свечения колоний.

В жидких питательных средах бруцеллы растут с равномерным помут­нением среды, медленным появлением небольшого, голубоватого в прохо­дящем свете пристеночного кольца или кольца и поверхностной пленки. На дне пробирки постепенно образуется рыхлый осадок.

Морфология и тинкториальные свойства клеток бруцелл в культуре. Из подозрительных колоний делают мазки, окрашивают по Граму, Коз­ловскому. Клетки бруцелл в культуре не отличаются по морфологии от кле­ток возбудителя в исходном материале (см. выше), жгутиков не имеют.

Идентификация бруцелл на уровне рода. Принимают во внимание время появления макроскопически видимого роста, на питательных средах — потребность в СО₂.Согласно действующему в РФ «Наставлению по диагностике бруцел­леза животных» (2000), при обнаружении в посевах бактерий, типичных по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам для бру­целл, проводят их серологическую идентификацию. Для целей серологи­ческой идентификации используют двухсуточные агаровые культуры ис­следуемых бактерий и диагностические агглютинирующие R- и S-сыворотки. На предметном стекле в каплях S- и R-сывороток, физиологического раствора суспензируют бактериологической петлей испытуемую культу­ру. Для контроля R-сыворотки проверяют в разведении, указанном био­фабрикой с роз-бенгал и цветным антигенами; S-сыворотки — в титре, ука­занном на коробке с цветным бруцеллезным антигеном и в неразведенном виде с роз-бенгал антигеном.

Если испытуемая культура дает положительную РА (два креста и более) с обеими или любой одной диагностической сывороткой и отрицательный ре­зультат с физиологическим раствором, то ее относят к бруцеллам.

Оценка результатов РА проводится при условии, что R- и S-сыворотки дают в контролях с гомологичными антигенами агглютинацию интенсив ностью минимум на три креста, при отсутствии реакции с гетерологичными антигенами. Агглютинация с R-сывороткой происходит замедленно, с ней всегда реагируют культуры В. ovis и В. canis.

Для идентификации выделенной культуры на уровне рода также иссле­дуют оксидазную, каталазную активность, наличие жгутиков, образова­ние индола, уреазы, способность редуцировать нитраты, агглютинировать в бруцеллезной позитивной сыворотке, а также патогенность для лабора­торных животных (см. «Биопробу»).

Бруцеллы не обладают подвижностью, образуют каталазу, обычно ок-сидазу (кроме В. ovis и В. neotomae) и уреазу (кроме В. ovis и некоторых штаммов В. melitensis), редуцируют нитраты, не образуют индол.

Наставлением по диагностике бруцеллеза животных (2000) в РФ пре­дусмотрено использование полимеразной цепной реакции.

Идентификация бруцелл на уровне вида и биовара. Критерии дифференциации видов и биоваров бруцелл представлены в таблицах.

Определение вида и биовара выделенной культуры бруцелл дает воз­можность более детально проводить эпизоотологический и эпидемиологи­ческий анализ.

Разработанные методы дифференциации видов бруцелл предполагают работу с бруцеллами в S-форме (кроме В.ovis и В. canis), поэтому перед проведением таких исследований проверяют популяцию на диссоциацию методом окраски колоний кристаллвиолетом по Уайту-Вильсону. Для этого готовят взвесь 48-часовой изучаемой агаровой культуры в стериль­ном физиологическом растворе концентрацией 0,5-1 млрд. микробных клеток в 1 мл по бруцеллезному стандарту мутности. Одну каплю взвеси засевают последовательно шпателем на поверхность агаровой среды в трех чашках Петри.

Посевы инкубируют 5 суток при 37-38°С. При таком методе посева на плотной среде вырастает достаточно большое количество изолирован­ных колоний бруцелл. В чашки Петри с колониями осторожно пасте­ровской пипеткой наливают рабочий раствор кристаллвиолета¹ тонким слоем. Через пять минут краситель осторожно отсасывают пипеткой и сливают в емкость с дезраствором. Затем колонии изучают при помощи стереоскопического микроскопа.

Диссоциированные колонии имеют цвет от темно-фиолетового до свет­ло-синего, S-колонии окрашиваются в светло-желтый, реже — в светло-зеленый цвет. Для изучения отвивают несколько колоний в
S-форме.