Методами генной инженерии

Повышение эффективности биотехнологии

Современные методы генной инженерии позволили получить сверхпродуценты, в которых продукт клонированного гена составляет 10 - 50 % растворимых белков. Важнейшими факторами, которые следует принимать во внимание при получении сверхпродуктов, являются вид микроорганизма-хозяина, стабильность рекомбинантной плазмиды, сила промотора, использование кодонов в мРНК, посттрансляционная модификация и локализация белка.

Основным способом увеличения выхода целевого продукта является способ увеличения количества копий гена (амплификация) в клетке введением нужного гена в многокопийные плазмиды. Этот подход используют как для собственных эндогенных генов клетки-хозяина, так и для генов, внесенных из другого организма.

Сверхпродуцент треонина получен путем амплификации генов, ответственных за синтез ферментов анаболизма треонина. Для этого использовано клонирование этих генов на одной из плазмид E.coli, представленной в клетке в количестве 40 - 50 копий. Ряд регуляторных мутаций, введенных в геном реципиентного штамма E.coli и в клонируемый оперон, позволили создать штамм, биосинтетическая активность которого более чем в 10 раз превосходит продуктивность исходного. Подобным образом сконструированы сверхпродуценты нескольких рестриктаз и ДНК-лигазы E.coli.

Для E.coli с успехом используются сильные промоторы lac, trp, tac и термоиндуцибельный промотор P_L фага лямбда. Для B.subtilis известны три сильных промотора Pen P, AI фага Ф29 и а-амилазы.

Важной задачей генной инженерии является расширение спектра субстратов, используемых промышленными микроорганизмами и микроорганизмами-очистителями окружающей среды. Так, с целью создания штаммов-продуцентов микробного белка, способных расти на таких дешевых субстратах, как молочная сыворотка и целлюлозосодержащие отходы, проводится клонирование в S.cerevisiae генов, кодирующих синтез Р-галактозидазы и ксилозоизомеразы.

Для пищевой промышленности важной задачей, в частности, является получение штаммов дрожжей, способных к непосредственному сбраживанию крахмала и целлюлозы, а также создание продуцентов пиранозооксидазы, участвующей в изомеризации глюкозы во фруктозу.

Проводятся работы по клонированию в S.cerevisae экзо- 1,4- D- изоксидазы Aspergillus awamori, экзоцеллюлобиогидролазы Trichoderma reesei ипиранозооксидазы Polyporus obtusius.

Путем расширения спектра используемых микроорганизмами субстратов достигается более эффективное предохранение окружающей среды от загрязнения. Так, с помощью переноса природных или конструированных плазмид созданы штаммы псевдомонад, способные утилизировать углеводы нефти, штаммы дрожжей, устойчивые к синтетическим органическим гербицидам, и др. различные штаммы микроорганизмов, эффективно разлагающие ксенобиотики.

Методами генетической инженерии также можно повысить эффективность использования субстрата и улучшить качество целевого продукта. Например, замена тратящей много энергии системы ассимиляции азота у Methylophylus methylotropus на более экономичную систему из E. Coli.

Методы генной инженерии могут быть использованы для повышения продуктивности биосинтеза путем увеличения устойчивости продуцентов к собственному целевому продукту. Например, биосинтез аминогликозидных антибиотиков может быть увеличен введением в геном стрептомицета генов, которые кодируют синтез трансформирующих аминогликозид ферментов.