Систематизация бактерий в Определителе Берджи

Классификация, морфология бактерий. Структура бактериальной клетки. Сложные методы окраски.

Прогресс в области клинической микробиологии и инфектологии в последние десятилетия расширил наши представления об известных возбудителях инфекционных болезней и позволил выявить ряд ранее неизвестных инфекций человека.

В связи с существенным расширением спектра возбудителей и нередко пересмотром роли некоторых из них в возникновении, развитии и распространении инфекций для практики все более актуальным становится вопрос о применении адекватных методов и средств выделения и точной идентификации возбудителя конкретного заболевания, а также адекватных средств этиотропной терапии и профилактики.

Успех классических методов обнаружения возбудителя инфекции зависит от правильного выбора вида и количества исследуемого материала, времени и техники его отбора, условий транспортирования, обработки, подбора методов и средств выделения и идентификации возбудителя. В каждом конкретном случае они определяются свойствами возбудителя, характером и стадией инфекции.

Следует подчеркнуть, что конечный результат исследования зависит не только (а иногда и не столько) от компетентности и адекватных действий микробиолога, но и от грамотности действий тех специалистов, которые имеют отношение к исследуемому материалу на долабораторном этапе.

Не менее важное значение имеет правильная интерпретация врачами результатов микробиологического анализа, что также требует достаточных знаний о свойствах возбудителей инфекций человека. Многообразие возбудителей бактериальных инфекций не должно быть препятствием на пути рационального контроля за болезнями этой группы

Несмотря на широкую распространенность вирусных инфекций, бактерии остаются наиболее часто распознаваемыми этиологическими агентами инфекционных заболеваний. В связи с этим представляются важными вопросы таксономии бактерий – их описания, названия и идентификации.

Микроорганизмы - это невидимые простым глазом представители трех царств: Эукариоты, Прокариоты, Вирусы.

Прокарнотическая клетка имеет средние размеры 1-10 мкм, генетический материал представлен кольцевой молекулой ДНК, расположенной свободно в цитоплазме, нет ядерной мембраны, отграничивающей генетический материал от цитоплазмы, гистоны отсутствуют. Синтез белка происходит на рибосомах 70 S, свободно расположенных в цитоплазме. Тип деления - бинарный. Клеточная стенка образована пептидогликаном. Анаэробное дыхание возможно.

Эукариотическая клетка имеет средние размеры 10-100 мкм. Генетический материал отграничен от цитоплазмы ядерной мембраной, имеет форму хромосомы, гистоны имеются, синтез белка осуществляется на рибосомах 80 S. Рибосомы находятся в составе эндоплазматической сети. Тип деления - митотический. Клеточная стенка (если есть) содержит хитин или целлюлозу. Имеются стеролы. Анаэробное дыхание отсутствует.

К прокариотам относятся бактерии (в т. ч. актиномицеты, цианобактерии, спирохеты, риккетсии, хламидии, микоплазмы) и архебактерии.

К эукариотическим микроорганизмам относятся грибы, простейшие, одноклеточные водоросли.

Вирусы - не имеют клеточного строения.

Таким образом, бактерии имеют следующие обязательные структуры:

· клеточную стенку (за исключением микоплазм),

· цитоплазматическую мембрану,

· цитоплазму,

· нуклеоид,

· рибосомы.

Необязательные (непостоянные структуры бактериальной клетки):

· капсула,

· жгутики,

· споры,

· включения в цитоплазме.

Биологическая классификация бактерий неоднократно пересматривалась. Но лишь современная классификация, представленная в Руководстве по систематике бактерий Берджи, содержит ясные указания о медицинском значении представителей конкретных таксонов.

Основой определения систематического положения являются: морфология и тинкториальные свойства клеток (форма, размеры, взаимное расположение, спорообразование, окраска по методу Грама и другими методами), культуральные, биохимические, антигенные характеристики, а также чувствительность к различным антимикробным воздействиям и степень генетического родства с представителями других таксонов (по процентному соотношению содержания гуанина и цитозина в геноме, гомологии нуклеиновых кислот и способности к обмену генетической информацией).

По уровню биологической организации бактерии стоят ниже эукариотических организмов (грибов, простейших, гельминтов).

Несмотря на введение новых методов таксономических исследований, вопрос о полной и всеобъемлющей классификации бактерий остается до конца нерешенным. Даже истинное родство, выявленное по гомологии нуклеиновых кислот, свидетельствует лишь о наличии общего предка и может быть оспоренным.

Наибольшее практическое значение имеют схемы идентификации, основанные на морфофизиологических, тинкториальных, метаболических и других легко выявляемых свойствах бактерий. Определение этих свойств в ходе диагностики позволяет не только выделять и идентифицировать чистые культуры, но и дифференцировать их с представителями сопутствующей микрофлоры, не связанными с заболеванием. Более того, даже начальные этапы исследования могут дать ценную информацию для выбора средств этиотропной терапии.

Морфология и тинкториальные свойства. По морфологическому принципу бактерии разделяют на:

· шаровидные (кокки),

· палочковидные (овоидные, коккобациллы, прямые, изогнутые, вибрионы, с закругленными, заостренными, "обрубленными" концами, ветвящиеся, нити)

· извитые формы (спиралевидные с одним или более завитками).

В зависимости от расположения в микропрепарате различают:

· одиночные,

· попарно расположенные клетки (диплококки),

· в виде тетрад (тетракокки),

· цепочек (стрептококки, стрептобациллы),

· пакетов (сарцины),

· беспорядочных скоплений (стафилококки).

Окрашивание препаратов проводится с помощью красителей, которые можно разделить на позитивные (метиленовый синий, фуксин) и негативные (нигрозин). Позитивными называются красители, окрашивающие микроорганизмы и другие находящиеся на стекле фиксированные объекты, негативными - красители, заполняющие пространство, окружающее микроорганизмы, в результате чего последние становятся видимыми в виде силуэтов на фоне красителя; кислые (эозин, конго красный) и щелочные (гематоксилин, толуидиновый синий, азур). Кислые красители связываются с веществами, имеющими щелочную реакцию (например, цитоплазматическими белками). Щелочные - связываются с базофильными (кислыми) компонентами клеток (нуклеиновыми кислотами, рибосомами).

Основные цвета окрашивания могут быть следующими:

а) красный (основной фуксин, кислый фуксин, сафранин, конго-красный);

б) фиолетовый (генциановый фиолетовый, метиловый фиолетовый, кри­сталлический фиолетовый);

в) синий (метиленовый синий, толуидиновый синий, водный синий);

г) зеленый (малахитовый зеленый, бриллиантовый зеленый).

Способность клеток воспринимать различные красители отражаетих тинкториальные свойства. Это определяется структурой и составом клеточной стенки.

Простыми методами окрашивания называют окрашивание препаратов каким-либо одним красителем. Чаще всего при этом используется фуксин, генциановый фиолетовый, метиленовый синий.

При сложных методах окрашивания на один и тот же препарат воздействуют несколькими красящими веществами, одно из которых называется основным, другие - дополнительными. Кроме красителей используются различные обесцвечивающие вещества: спирты, кислоты, ацетон и др., которые играют роль дифференциаторов. С помощью сложных методов окрашивания выявляют цитологические особенности клеток микроорганизмов (клеточные структуры, запасные вещества, включения и т. д.)

Наибольшее значение для идентификации имеет использование сложных (дифференцирующих) методов, в первую очередь метода Грама, позволяющего различить:

· грамположительные

· грамотрицательные бактерии.

При окраске этим методом грамположительные бактерии окрашиваются в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные – в бордово-красный, что отражает различия в строении клеточных стенок бактерий двух групп.

На основании результатов микроскопии окрашенных по методу Грама препаратов из патологического материала можно ориентировочно судить о составе микрофлоры и степени микробной обсемененности материала, что позволяет выбрать более адекватные методы и средства диагностики и начальной антимикробной терапии. Так, например, при обнаружении стрептококков препаратом выбора должен быть пенициллин.

Результаты параллельного выделения и идентификации возбудителя с дальнейшим определением чувствительности уточняют сделанный выбор.

Из других методов часто используют окраску по Цилю–Нильсену, позволяющую выявить кислотоустойчивые формы бактерии (Mycobacterium spp., Nocardia spp.) и споры (покоящиеся формы). Например, микобактерии туберкулеза окрашиваются в красный цвет, а некислотоустойчивые клетки – в синий.

По наличию особых (необязательных) структурных элементов различают бактерии:

· спорообразующие (Clostridia spp., Bacillus spp.) и аспорогенные (энтеробактерии и др.);

· капсулированные (Klebsiella spp., S.pneumoniae, B.anthracis и др.);

бескапсульные (Vibrio spp., Brucella spp. и др.);

· подвижные (образующие жгутики), например многие грамотрицательные палочки и неподвижные (многие кокки).

Среди патогенных для человека преобладают микроорганизмы с окислительным или окислительным и бродильным типом метаболизма (аэробы и факультативные анаэробы соответственно).

Большинство клинически значимых видов относят к мезофилам – для них температурный оптимум роста находится в пределах 25–40^oС (в отличие от психрофилов и термофилов, имеющих соответственно более низкие или более высокие значения оптимума).

По способности расти на простых (универсальных) питательных средах (по типу мясопептонного бульона или агара Хоттингера) различают бактерии неприхотливые (Staphylococcus spp., энтеробактерии и др.) и прихотливые (Streptococcus spp., Haemophilus spp., Neisseria spp. и др.).

Прихотливые бактерии могут расти только в присутствии обогащающих среду добавок (крови, ее сыворотки, дрожжевого экстракта и др.), содержащих факторы роста – гемин, витамины, аминокислоты, нуклеотиды, липиды. Бактерии, зависящие от тех или иных факторов роста и неспособные синтезировать какие-либо соединения из глюкозы и солей аммония как единственных источников углерода и азота, называют ауксотрофами. Ауксотрофность характерна для многих патогенных бактерий.

Принципы идентификации, изложенные в Определителе бактерий Берджи, 9-е издание которого вышло в 1994 г., нашли наибольшее распространение в практической бактериологии. В соответствии с ними (на основе строения клеточной стенки и отношения к окраске по Граму) бактерии разделены на 35 групп, входящих в 4 категории:

I – грамотрицательные эубактерии;

II – грамположительные эубактерии;

III – эубактерии, лишенные клеточной стенки – микоплазмы (Mollicutes);

IV – археобактерии (Archaea).

Сложные методы окраски используются для выявления отдельных структур клетки и требуют применения двух и более красителей и воздействия некоторых дополнительных веществ и физических факторов.

К сложным методам окраски относятся:

по Романовскому-Гимзе;

по Граму;

по Нейссеру;