Техника определения резус — фактора

Экспресс-метод определения стандартным универсальным реагентом в пробирке без подогрева

Для исследования можно использовать свежую несвернувшуюся кровь, взятую из пальца (или вены) непосредственно перед исследованием, или консервированную кровь без предварительной обработки, а также эритроциты из пробирки после формирования сгустка и отстаивания сыворотки.

Методика проведения реакции. Исследование проводят в центрифужных пробирках объёмом не менее 10 мл. На дно пробирки вносят одну каплю стандартного универсального реагента, представляющего собой антирезусную сыворотку группы АВ(IV), разведённую 33% раствором декстрана. Затем в неё добавляют одну каплю исследуемой крови (или эритроцитов). Круговым вращением пробирки содержимое размазывают по её внутренней поверхности таким образом, чтобы содержимое растеклось по стенкам. Это значительно ускоряет агглютинацию и делает её крупнолепестковой. Агглютинация на стенках пробирки наступает, как правило, в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и чёткой агглютинации наблюдать следует не менее 3 мин. Затем для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают путём одно-двукратного перевертывания пробирки (без взбалтывания!).

Трактовка результатов. Наличие агглютинации (крупные хлопья на фоне просветлённой жидкости) указывает на резус-положительную принадлежность исследуемой крови. Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная розовая жидкость) свидетельствует о резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.

Лабораторные способы определения резус-фактора

Для определения резус-принадлежности крови больного в условиях лаборатории применяют четыре основных метода.

Метод агглютинации в солевой среде

Используют специальные сыворотки, содержащие полные антитела анти-резус. Эритроциты в виде 2% взвеси в изотоническом ра- створе хлорида натрия соединяют в пробирках с антирезусной сывороткой. Пробирки помещают на 1 ч в термостат при температуре 37?С, после чего осадок эритроцитов на дне пробирки рассматривают с помощью лупы и по его форме учитывают результат. При положительном результате (Rh+) осадок имеет характерный рисунок в виде нитей или зернистости. При отрицательном (Rh-) осадок размещается равномерным слоем и имеет вид правильно очерченного круга.

Метод агглютинации в присутствии желатина

B две пробирки помещают по 0,02-0,03 мл осадка исследуемых эритроцитов. Затем в первую пробирку добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) анти-резусной сыворотки, во вторую (контрольную) пробирку - 2 капли (0,1 мл) 10% раствора желатина и 2 капли (0,1 мл) физиологического раствора.

Содержимое осторожно перемешивают. Затем пробирки инкубируют в термостате при температуре 45-48?С в течение 30 мин, после чего добавляют 5-8 мл физиологического раствора и переворачивают пробирки 1-2 раза для перемешивания.

Результат учитывают, просматривая пробирки на свет невоору- жённым глазом или через лупу. Eсли эритроциты резус-положи- тельны, произойдёт их агглютинация. Отсутствие агглютинации свидетельствует о том, что испытуемая кровь резус-отрицательная. B контрольной пробирке агглютинация эритроцитов должна отсутствовать.

Непрямой антиглобулиновыи тест (реакция Кумбса)

Эта реакция наиболее чувствительна для выявления неполных антител к ауто- и изоантигенам эритроцитов. К ней, как правило, прибегают при возникновении трудностей в определении резус-при- надлежности крови, связанных с нечёткими результатами, полученными при других методах исследования. Реакция основана на использовании антиглобулиновой сыворотки.

При обработке резус-положительных эритроцитов неполными антителами анти-Rh наступает их обволакивание, сенсибилизация по отношению к антиглобулиновой сыворотке, которая агглютинирует сенсибилизированные эритроциты, поскольку имеет антитела к глобулинам.

В пробирку вносят антирезусную сыворотку и отмытые физиологическим раствором эритроциты, помещают на 1 ч в термостат при температуре 37?С, после чего эритроциты тщательно отмывают. Последующий этап реакции проводят на плоскости. Каплю взвеси эритроцитов смешивают с равным количеством антиглобулиновой сыворотки и учитывают результат. Наличие агглютинации - показатель того, что исследуемый образец крови резус-положительный. Если агглютинация отсутствует, то испытуемая кровь резус-отрицательная.

Реакция с анти-D-моноклональными антителами

На планшете смешивают большую каплю (0,1 мл) анти-D-моноклональных антител и маленькую каплю (0,01 мл) исследуемой крови.

За реакцией наблюдают в течение 3 мин. При смешивании анти- D-MKA с образцами резус-положительных эритроцитов отмечают быстро наступающую лепестковую агглютинацию. Если кровь резусотрицательная, агглютинация отсутствует.

48. Проба на совместимость по резус — фактору.

Оснащение: кровь донора, сыворотка реципиента, 33% раствор полиглюкина, центрифужная пробирка, физиологический раствор натрия хлорида, пипетки.

Последовательность действий:

а) Из вены реципиента взять 3-5 мл крови, центрифугировать.

б) На дно центрифужной пробирки разными пипетками нанести 2 капли сыворотки больного, 1 каплю донорской крови и 1 каплю 33% раствора полиглюкина.

в) Содержимое перемешать, наклонив пробирку почти до горизонтального положения и медленно вращать вокруг оси, распределив содержимое по стенкам ровным слоем.

г) Процедуру продолжать в течение 5 минут.

д) Через 5 минут добавить 3-4 мл физиологического раствора хлорида натрия.

е) Содержимое перемешивать, 2-3 раза наклоняя пробирку до горизонтальной плоскости (не взбалтывать!).

Трактовка результатов:

Отсутствие агглютинации, равномерное окрашивание содержимого пробирки свидетельствуют о резус-совместимости крови донора и реципиента; наличие агглютинации - о несовместимости крови донора и реципиента по резус-фактору

После проведения первой пробы необходимо провести пробу на совместимость по Rh-фактору. Для этого существует 2 доступных метода — реакция в сывороточной среде и в желатине.

Первый метод: на чашку Петри наносят 1—2 капли сыворотки больного и маленькую каплю донорской крови, после чего ее на 10 минут ставят в водяную баню (+46~+48 °С). Наличие агглютинации свидетельствует о несовместимости.

Второй метод: на дно пробирки помещают маленькую каплю донорской крови, добавляют 2 капли подогретого 10 % раствора желатина и 2 капли сыворотки крови больного. Через 10 минут инкубирования в водяной бане при. температуре +46—+48 °С в пробирку добавляют 5 мл подогретого изотонического раствора хлорида натрия. 'Наличие агглютинации свидетельствует о несовместимости крови донора и реципиента.

Следует отметить, что изоиммунные антитела и антитела других систем выявляются теми же методами, что и антитела анти-Rh, а некоторые — как антитела системы АВО. Поэтому несовместимость крови донора по этим антителам может быть выявлена при выполнении указанных проб на совместимость.