Работа № 2. Определение содержания общего холестерина в сыворотке и плазме крови ферментативным колориметрическим методом

Принцип метода. Определение основано на ферментативном (с участием холестеролэстеразы - ХЭ) гидролизе эфиросвязанной фракции холестерина и окислении всего содержащегося в исследуемой биологической жидкости свободного холестерина под влиянием холестеролоксидазы (ХО). Реакция сопровождается высвобождением пероксида водорода, вызывающего катализируемое пероксидазой (ПО) превращение 4-аминоантипирина (4-ААП) и фенола в окрашенное соединение (хинонимин) розово-малиного цвета с максимумом поглощения при 500 нм. Интенсивность окраски образовавшегося продукта пропорциональна концентрации холестерина.

Эфиры холестерина + Н₂О → холестерин + жирные кислоты,

^ХЭ

Холестерин + О₂ → холестенон + Н₂О₂,

^ХО

2 Н₂О₂ + 4-ААП + фенол → хинонимин +4 Н₂О.

^ПО

Ход работы. Приготовить опытные пробы (0,02 мл сыворотки крови и 2 мл рабочего реагента), холостую пробу (0,02 мл дистиллированной воды и 2 мл рабочего реагента) и пробу с калибратором (0,02 мл калибратора и 2 мл рабочего реагента). Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при температуре 37°С. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и инкубировать еще 20 минут при температуре 37°С. Окрашенные пробы фотометрировать при 500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм относительно холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной температуре. Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:

С = (Е_оп/Е_к) × 5 ммоль/л.

где: Е_оп и Е_к – оптическая плотность исследуемой пробы и пробы с калибратором, соответственно. При результате выше 13 ммоль/л пробы следует развести в два раза дистиллированной водой, повторить анализ и полученный результат умножить на 2.

Ход работы. Приготовить пробы:

Реакционные смеси перемешать и инкубировать в течение 20 минут при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность опытной и калибровочной проб против холостой пробы при длине волны 500 нм в кюветах с шириной слоя 5 мм. Окраска раствора стабильна в течение 2 часов при предохранении от прямого солнечного света.

Расчет. Содержание холестерина в сыворотке крови (С) в ммоль/л определяют по формуле:

С = 5,17 × Е_оп/Е_к,

где: Е_оп и Е_к – оптическая плотность исследуемой пробы и пробы с калибратором, соответственно;

5,17 – концентрация холестерина в калибраторе, ммоль/л.

При результате выше 13 ммоль/л пробы следует развести в два раза дистиллированной водой, повторить анализ и полученный результат умножить на 2.

Интерпретация результатов анализа:

Уровень холестерина в крови (показатели концентрации холестерина в сыворотке крови):

нормальный (желаемый) - < 5,2 ммоль/л,

погранично-высокий – 5,2 - 6,2 ммоль/л,

высокий - > 6,2 или 6,7 ммоль/л соответственно для мужчин и женщин старше 20 лет;

умеренная гиперхолестеринемия – 6,2-7,5 или 6,5-7,8 ммоль/л;

тяжелая гиперхолестеринемия - > 7,5 или > 7,8 ммоль/л.