Протеомные методы валидации потенциальных мишеней

Протеомные методы незаменимы для предва­рительной валидации потенциальных мишеней, по­зволяющей исключить из списка явно «неправильные» мишени. Первоначально необходимо проверить, су­ществует ли реально в целевом организме белок, вы­бранный в качестве потенциальной мишени чисто теоретически, на основе геномной информации. Для этой цели полностью подходит стандартная схема протеомного картирования белков микроорганизма: 1) получение био­логического образца; 2) экстракция белков; 3) разде­ление белков (двумерный электрофорез или хромато­графия); 4) трипсинизация белков (частичный протеолиз белков под действием трипсина); 5) масс-спект­рометрический анализ; 6) биоинформационная иден­тификация белков на основе сравнительного анализа экспериментальных и теоретических масс-спектров. В случае создания антимикробного средства с широким спектром действия необходимо проверить экспрессию целевого белка у всех микроорганизмов целевой группы.

В результате предварительной валидации белков-мишеней должны быть получены протеомные карты для различных штаммов целевых микроорганизмов. Если обнаружится вариабельность экспрессии белка, то такой белок может быть исключен из списка по­тенциальных мишеней по соображению возможного проявления лекарственной резистентности.

Геномные методы валидации потенциальных мишеней.

Последующая валидация мишеней, успешно про­шедших проверку протеомными методами, может быть выполнена различными геномными методами, включающими такие процедуры как:

1. Инактивация целевого гена в результате мутаций;

2. Подавление транскрипции гена;

3. Разрушение целевой мРНК (использование рибозимов ималых интерферирующих РНК (siRNA);

4. Подавление трансляции (использование антисмысловых РНК и их аналогов);

5. Прямая инактивация целевого белка с помощью специфических антител конъюгированных с ингибиторами белков.

Большинство этих подходов основано на од­ной общей идее - проверить функциональную зна­чимость потенциальной белковой мишени путем ос­тановки ее экспрессии на одном из этапов «от гена до белка». Естественно, наиболее эффективны геномные методы блокирования экспрессии целевого белка в быстро растущих клетках. В тех случаях, когда потенциальная мишень существует длительное время и ее обновление происходит крайне медленно, более предпочтительны методы прямой инактивации белка.