2014-09-04
2012
Культуры животных и растительных клеток предъявляют очень высокие требования к стерильности питательных сред и наличию в них различных токсичных веществ.
“Дикие” микроорганизмы, которые могут попасть в такую “богатую”питательную среду очень быстро вытеснят растительные или животные клетки, кроме того, токсины, которые они выделяют, могут ингибировать рост клеток или вызывать гибель культуры. Поэтому при всех манипуляциях с клетками и тканями при культивировании in vitro соблюдают определенные правила асептики в ламинар - боксе или в асептических комнатах. В первом случае асептика достигается подачей профильтрованного стерильного воздуха, направленного из ламинкар-бокса наружу, на работающего. Асептические комнаты стерилизуют с помощью ультрафиолетовых ламп, а работают в таких помещениях в стерильной одежде. Рабочую поверхность столов в асептических комнатах и инструменты перед работой дополнительно стерилизуют спиртом.
Чистую посуду, предварительно завернутую в бумагу или в фольгу, инструменты, бумагу, вату стерилизуют сухим жаром в сушильном шкафу при температуре 160°С в течение 1,5 - 2 ч. Питательные среды стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С и повышенном давлении в течение 15 - 20 мин. Если в состав питательных сред входят вещества, разрушающиеся при автоклавировании, их следует стерилизовать путем фильтрации через бактериальный фильтр. Затем стерильные профильтрованные компоненты добавляют в проавтоклавированную среду, охлажденную до температуры 40 "С.
Клетки в культуре требуют отсутствия в ростовой среде любых токсических веществ. Вода, используемая для приготовления относительно небольших объемов питательных сред, должна быть вначале деионизирована, а затем перегнана в стеклянной посуде. Хранить такую воду следует в стеклянной или пластиковой посуде. В связи с потребностью для культивирования клеток больших количеств воды высокой степени чистоты разработаны высокоэффективные технологические процессы получения очищенной воды методами обессоливания, такими, как ультрафильтрация, ионный обмен, обратный осмос, электролиз. Для культур клеток используется высокоочищенная вода, обычно получаемая комбинацией нескольких методов, например, электродиализа и ионного обмена, ионирования и дистилляции. Большое распространение получили мембранные методы очистки воды, которые отличаются высокой эффективностью и экономичностью. Так компактные уста-новки Ulttipoie, (США) обеспечивают полную очистку воды и постоянный контроль за ее качеством.
Антибиотики вводятся в состав питательных сред для подавления бактериальной инфекции. Однако, использование антибиотиков при культивировании клеток целесообразно только в случае кратковременных культур, а постоянное пассирование (пересев) клеточных линий должно проводиться в отсутствие антибиотиков, чтобы не способствовать отбору устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий.
Растительные ткани сами по себе могут служить серьезным источником заражения, так как на их поверхности всегда находится эпифитная микрофлора. Поэтому необходима поверхностная стерилизация, которую проводят следующим образом. Предварительно часть растения, из которой будет извлечен эксплант (образец ткани для культивирования), промывают водой с мылом и споласкивают чистой водой. Затем растительный материал стерилизуют в растворах дезинфицирующих веществ. После выдерживания эксплантов в дезинфицирующем растворе их несколько раз промывают в дистиллированной воде и скальпелем удаляют наружный слой клеток на срезах эксплантов, так как он может быть поврежден при стерилизации.
Микроорганизмы могут находиться и внутри растительной ткани. Наиболее часто внутреннее инфицирование встречается у тропических и субтропических растений. Поэтому кроме поверхностной стерилизации иногда приходится применять антибиотики, которые и убивают микробную флору внутри ткани. Следует, однако, заметить, что подобная обработка не всегда приводит к стерилизации внутренних тканей, так как трудно выбрать направленно действующий антибиотик.
