IV. Методы анализа амплифицированных фрагментов

Анализ амплифицированных фрагментов позволяет:

1) идентифицировать микроорганизмы;

2) выявлять подтипы микроорганизмов одного вида;

3) выявлять мутации в ДНК.

Внутривидовое типирование особенно важно при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами, генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов.

1. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ, англ. - RFLP). Используя ПЦР, амплифицируют определенный генетический локус. Далее продукт амплификации расщепляют рестрикционными эндонуклеазами. При этом образуются фрагменты различного размера, которые при проведении электрофореза образуют профили, различные у разных видов (вариантов) микроорганизмов.

2. Полиморфизм длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ, англ. – AFLP). В отличие от предыдущего метода рестрикцию проводят до ПЦР. ДНК тест-микроорганизма с использованием рестриктазы нарезают на фрагменты, затем проводят ПЦР.В результате образуются фрагменты различного размера, которые при проведении электрофореза образуют профили, различные у разных видов (вариантов) микроорганизмов.

3. Полиморфизм конформации однонитевой ДНК (ПЦР-SSCP). Используют для выявления точечных мутаций в ДНК. Проводят ассиметричную ПЦР, что сопровождается накоплением однонитевых молекул ДНК, которые разделяют при помощи электрофореза в денатурирующем геле, позволяющем разделять фрагменты, отличающиеся друг от друга одним нуклеотидом.