1. Проведение ПЦР. Позволяет получить множественные копии небольших фрагментов ДНК размером от 300 до 1000 нуклеотидов. Секвенирование больших фрагментов затруднено, так как при проведении их электрофореза невозможно выявить фрагменты, отличающиеся в один нуклеотид.
2. Очистка амплифицированных фрагментов ДНК. Проводят очистку ампликонов от шлаков – остатков ПЦР реакции (праймеров, несвязавшихся нуклеотидов).
3. Секвенирование. Проводят ряд последовательных стадий (рис. 38):
а) приготовление реакционной смеси, которая содержит:
- изучаемую ДНК,
- праймер,
- ДНК-полимеразу и буфер для неё,
- дезоксинуклеотидтрифосфаты (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ),
- меченые флюоресцентной меткой дидезоксинуклеотиды, которые обрывают синтез цепочки ДНК, так как лишены 3'-OH группы, необходимой для образования мостика между двумя нуклеотидами;
б) проведение реакции ПЦР-секвенирования;
Рис. 38. Этапы секвенирования
|
|
|
| |||
| |||