Методы изучения ферментативной активности бактерий

Состав ферментов бактерий определяется геномом и поэтому характерен для тех или иных видов, т.е. является видовым признаком. Поэтому изучение ферментативных или биохимических свойств очень важно для дифференциации (отличия) и идентификации (определения вида) бактерий. Наиболее часто определяют ферменты класса гидролаз и оксидоредуктаз.

Среди ферментов оксидоредуктаз для идентификации микроорганизмов используют такие ферменты, как каталаза и цитохромоксидаза (ЦО).

Каталаза – фермент, расщепляющий Н₂О₂ с образованием водорода и кислорода. Обнаружить каталазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться после смешивания микробных клеток с 1 % р-ром Н₂О₂.

Цитохромоксидазу обнаруживают так: смачивают реактивом бумажку и наносят суточную культуру микроорганизмов. Получается синее окрашивание.

Среди ферментов гидролаз изучаются ферменты, расщепляющие углеводы (или сахара) и ферменты, расщепляющие белки (или протеины). Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитическими свойствами, а способность расщеплять белки - протеолитическими свойствами.

Эти свойства выявляются по конечным продуктам расщепления после посева на определенные среды.. При распаде сахаров определяют образование кислот (молочной, уксусной, муравьиной) и газов (СО₂ или Н₂), а при распаде белков - образование щелочей, H₂S, NH₃.

Совокупность сахаролитических, протеолитических и других ферментативных свойств бактерий называется биохимическими свойствами бактерий.

Изучение сахаролитических свойств.

Для определения сахаролитических свойств используются среды: плотные среды Эндо, Левина и Плоскирева, а также жидкие и полужидкие среды Гисса.

Среды Эндо, Левина, Плоскирева содержат лактоз у и определенный индикатор.

Эти среды позволяют отличить патогенные бактерии от кишечной палочки - E. coli. E. coli способна расщеплять лактозу, т.к. имеет фермент галактозидазу. При расщеплении лактозы образуются кислые продукты, которые изменяют цвет индикатора. Поэтому E. coli образует на средах окрашенные колонии: на среде Эндо - красные колонии с металлическим блеском; на среде Левина – темно-синие колонии; на среде Плоскирева – красные колонии. Сальмонеллы и шигеллы не имеют фермента галактозидазу, они не расщепляют лактозу, и цвет среды не изменяется. Поэтому сальмонеллы и шигеллы образуют на средах Эндо, Левина и Плоскирева бесцветные колонии.

Таким образом, на одной и той же среде наблюдается различный характер роста разных видов бактерий, т.к. они имеют различные ферменты. Это позволяет отличить один вид от другого.

Среды Гисса содержат лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и маннит и различные индикаторы. Если бактерии расщепляют углевод до образования кислых продуктов, наблюдается изменение цвета среды, а если до кислоты и газа – наблюдают появление газообразных продуктов.

Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 1 % углевода и индикатора Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). В среду опускается поплавок, который при стерилизации заполняется средой. Исходный цвет среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода цвет среды становится ярко-розовым (красным). Если образуется газ, он накапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.

Полужидкие среды Гисса состоят из 0,2-0,5 % мясо-пептонного агара (МПА), 1 % углевода и индикатора ВР (водно-голубая краска и розоловая кислота). Исходный цвет среды - розовато-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а если образуется газ, наблюдаются разрывы в среде.

Определенный вид бактерий ферментирует не все, а только некоторые углеводы, поэтому в одних пробирках цвет изменяется, а в других – не изменяется, и получается "пестрый ряд". Каждый вид бактерий характеризуется своим "пестрым рядом".

Изучение протеолитических свойств.

Протеолитические свойства бактерий изучают:

а) по способности разжижать желатин: разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина; S. aureus – в виде воронки; Bac. antracis – в виде опрокинутой елки; Vibrio cholerae – в виде гвоздя и т.д. Разжижают желатин бактерии, имеющие фермент - коллагеназа;

б) по конечным продуктам распада белков после посева на мясо-пептонный бульон (МПБ). Могут быть следующие конечные продукты: индол, Н₂S, NH₃.

Для обнаружения этих продуктов используют бумажки с индикаторами. Индикатор для индола - щавелевая кислота (бумажка окрашивается в розовый цвет). Для Н₂S – ацетат свинца (черный цвет). Для NH₃ – лакмусовая бумажка (синий цвет).

Дополнительно изучаются такие свойства, как восстановление нитратов в нитриты, бутандиоловое брожения на среде Кларка, расщепление крахмала и др.