Микробиологические основы химиотерапии инфекционных болезней

1. Определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом дисков (диффузионный тест) - демонстрация. Метод основан на подавлении роста бактерий на плотной питательной среде под действием строго определенной концентрации антибиотика, содержащегося в стандартном бумажном диске. Препарат, диффундируя в агар создает вокруг диска градиент концентрации антибиотика с формированием зоны задержки роста, размер которой зависит от чувствительности бактерии и свойств антибиотика. Содержание препарата определяется исходя из терапевтических концентраций каждого антибиотика и средних значений минимальных подавляющих концентраций для патогенных бактерий. Исследуемую бактериальную культуру, суспендированную в физиологическом растворе, засевают газоном в чашки Петри на специальные питательные среды (Мюллера-Хинтон или АГВ, не препятствующих диффузии антимикробных веществ и не оказывающих на них отрицательного действия), на поверхность которых накладывают диски с антибиотиками. Посевы инкубируют 18—20 ч при 37⁰ С. Учет результатов осуществляют путем измерения диаметра зоны полной задержки роста. Вывод о чувствительности бактерий к антибиотикам осуществляют с учетом специально разработанных критериев.

2. Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам методом серийных разведении (демонстрация). Метод применяют для определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) — наименьшей концентрации антибиотика, полностью угнетающей рост исследуемых бак­терий. Для этого готовят основной раствор антибиотика, содержащий препарат в определенной концентрации (мкг/мл или ЕД/мл) в физиологическом, буферном растворе или в специальном растворителе. Основной раствор используют для приготовления 2-кратных серийных разведений антибиотика (от 1 до 128 ед/мл) в питательной среде — бульоне (в объеме 1 мл) или агаре. Из исследуемой бактериальной культуры готовят суспензию стандартной плотности и засевают по 0,1 мл на среды с разной концентрацией антибиотика, а также на среду без препарата (контроль культуры). Посевы инкубируют при 37⁰ С в течение 20—24 ч или более (для медленно растущих бактерий), после чего отмечают результаты опыта по помутнению питательного бульона или появлению видимого роста бактерий на агаре, сравнивая с контролем. Наименьшая концентрация антибиотика, полностью подавляющая рост исследуемой культуры, принимается за МПК.

3. Микротест-системы для определения чувствительности к антимикробным препаратам (демонстрация) предназначены для быстрого определения клинической чувствительности бактерий к антибиотикам, которые в 2 стандартных концентрациях (средней терапевтической и максимальной) находятся в лунках пластиковых планшетов. Мерной бактериологической петлей (объем 1 мкл) исследуемую чистую культуру вносят в 5 мл стандартной питательной среды, содержащей индикатор, приготовленную бактериальную суспензию разливают в лунки планшета по 0,1 мл и инкубируют при оптимальных для данного вида бактерий условиях температуры и газового состава среды. О росте бактерий судят по изменению цвета индикатора. Если бактерии сохраняют жизнеспособность в присутствии антибиотика, выделение продуктов метаболизма приводит к изменению цвета индикатора. Отсутствие изменения цвета свидетельствует о полном подавлении жизнедеятельности микроба. Результаты определяют через 4 ч инкубации с помощью спектрофотометра.

4. Количественное определение чувствительности бактерий к антимикробным препаратам с помощью Е-теста. Е-тест является вариантом диффузионного метода, позволяющим определять МПК антибиотика. Для этого вместо индикаторных дисков с антибиотиками используют особые полимерные полоски, содержащие иммобилизованные антимикробные препараты в виде непрерывного градиента концентраций от 0,016 до 256 мкг/мл. На другой стороне полоски Е-теста нанесена шкала значений МПК. При помещении полоски на поверхность агара регулируемый процесс диффузии обеспечивает создание в питательной среде вокруг полоски стабильного градиента концентрации препарата, соответствующего шкале. После инкубации посева вокруг полоски образуется зона задержки роста, имеющая форму эллипса. Значение МПК соответствует месту пересечения эллипсовидной зоны с полоской Е-теста. Для интерпретации результатов (оценки клинической чувствительности) используют стандартные критерии.