Метод «мини-клеток»

Мини-клетки – бактериальные клетки, лишенные нуклеоида и образующиеся при нарушении процесса деления. Мини-клетки возникают на полюсах нормальных клеток и имеют небольшие размеры, однако обладают нормальным аппаратом транскрипции и трансляции.

Использование мини-клеток: 1) изучение функционирования захваченных из материнской клетки плазмид

2) изучение функционирования введенных извне рекДНК

Получают мини-клетки путем блокирования донорных клеток в митозе колцемидом. Колцемид – синтетический аналог колхицина, используется для ингибирования деления клеток на стадии метафазы. Обладает более мягким действием. Также используется для получения полиплоидных форм растений, т.к. разрушает белковые микротрубочки веретена деления и препятствует расхождению удвоившихся в процессе митоза хромосом.

Продуцент мини-клеток: E. Coli.

При продолжительной обработке клеток колцемидом в них вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Обработка цитохалазином В и центрифугирование приводит к образованию мини-клеток, представляющих микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану.

Цитохалазин В – продукт метаболизма некоторых плесневых грибов, обладающий свойствами ингибитора цитокинеза.

Полученные мини-клетки очень чувствительны к разного рода воздействиям, поэтому для слияния подбирают специальные мягкие условия.

Метод основан на том, что при смешении клеток они могут спонтанно сливаться, однако событие это чрезвычайно редкое. Используют химический индуктор –полиэтиленгликоль. Метод пригоден для слияния клеток одного либо разных видов

Частота слияния: 10^-7-10^-5 клеток.

Недостатки: метод требует высокой квалификации специалистов, трудновоспроизводим, эффективность низкая.

Упаковка в липосомы

используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз.

Липосомы - сферические оболочки, состоящие из фосфолипидов. Получают их путем резкого встряхивания смеси водного раствора и липидов, либо обрабатывая ультразвуком водные эмульсии фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфатидилсерина и холестерина наиболее пригодны для введения ДНК в клетки животных и растений. Метод используется для защиты рекДНК от действия внеклеточных нуклеаз.

Преимущества: Системы переноса с помощью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.