2015-04-30
1478
1) плазмиды агробактерий Agrobacterium tumefaciens,которые являются естественным вектором для горизонтального переноса генов у двудольных растений. Эти бактерии вызывают образование опухолей стебля двудольных растений - корончатых галлов. Причиной опухолеобразования являются так называемые Ti-плазмиды (от англ. tumor inducing- индуцирующая опухоль. Ti-плазмида проникает из клетки бактерии в растение и часть ее, называемая Т-ДНК (от англ. transferred DNA- переносящаяся), ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемого растения.
Размер всей Ti-плазмиды составляет 200-250 тпн, размер T-ДНК в разных плазмидах варьирует от 10 до 30 тпн (что составляет примерно 10% Ti-плазмиды). На T-области картировано не менее 7 генов, каждый из которых регулируется собственным промотором (что сходно с генами эукариот). Эти гены отвечают за синтез опинов (тип которых, например, нопалин, октопин, агроцинопин, манопин зависит от штамма агробактерии, вызывающего его образование) и подавление дифференцировки клеток (онкогены) - подавление образования корней и побегов. Эти гены функционируют лишь после их переноса в растительную клетку. С концов T-ДНК ограничена правым и левым прямыми повторами из 25 пн, что придает ей сходство с мобильными генетическими элементами. Поэтому любая ДНК, вставленная между этими повторами, будет принята за T-ДНК и перенесена в растительную клетку. Важно отметить, что все гены (их около 35), ответственные за перенос и интеграцию T-ДНК, находятся не в T-ДНК, а в области вирулентности (vir-область).
Однако практическое использование природных Ti-плазмид как векторов для переноса генетической информации в растительные клетки и клонирования генов затруднено из-за ее больших размеров (до 250 тпн, тогда как для прокариот вектор pBR322 имеет размеры всего 4,4 тпн). Учеными были разработаны различные стратегии введения чужеродных генов в состав T-ДНК, одна из которых, нашедшая широкое применение, - создание бинарной векторной системы. В этом случае конструируют два вектора, один из которых содержит область T-ДНК, а другой - гены vir-области, обеспечивающие все функции переноса T-ДНК в геном растительных клеток. Трансгены, кодирующие хозяйственно ценные признаки, встраивают в T-ДНК. Эта же область снабжается маркерными генами, эукариотическим промотором и уникальными сайтами рестрикции. Причем, гены, подавляющие дифференцировку растительных клеток и вызывающие развитие опухоли (онкогены), инактивируются или вырезаются, вследствие чего рост трансформированных растений не нарушается.
В последние годы для создания искусственных векторов используется Ri-плазмида (от англ. root inducing - индуцирующая корни), присутствующая в штаммах Agrobacterium rhizogenes. Ri-плазмиды выгодно отличаются от Ti-плазмид тем, что они являются естественными безвредными векторами, т.е. после встраивания T-ДНК в хромосомную ДНК растительных клеток в области заражения наблюдается усиленное образование корешков ("бородатость"), из которых легче регенерировать здоровые плодовитые растения, чем из недифференцированной ткани опухоли.
Необходимым условием для инфекции Ti-плазмиды является поранение растения. Поэтому агробактерии, содержащие рекомбинантные плазмиды, наносят на срезанную часть растения (например, побег) или осуществляют совместное культивирование (кокультивирование) агробактерий и стерильного растительного материала (например, сегментов междоузлий, листовых дисков, протопластов) на питательных средах в условиях in vitro.
2) Прямой физический перенос ДНК в клетку, который используется для трансформации устойчивых к агробактериям растений. Сюда включают: бомбардировку микрочастицами или баллистический метод; электропорацию; обработку полиэтиленгликолем; перенос ДНК в составе липосом. Наиболее продуктивным и чаще всего используемым является метод бомбардировки микрочастицами. При достаточной скорости эти частицы могут непосредственно проникать в ядро, что сильно повышает эффективность трансформации. Этим же методом можно трансформировать и другие ДНК-содержащие клеточные органеллы - хлоропласты и митохондрии
3) Использование антисмысловых ( перевернутых) РНК что позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора к-ДНК встраиваемого гена переворачивают на 180°. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс и закодированный белок не синтезируется.
Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена, контролирующего синтез полигалактуроназы - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибковым заболеваниям.
Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген, продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. Этилен - это газообразный гормон, одной из функций которого является контроль за процессом созревания плодов.
Cтратегия антисмысловых конструкций широко применима для модификации экспрессии генов. Эта стратегия используется не только для получения растений с новыми качествами, но и для фундаментальных исследований в генетике растений.
4) Агролистический метод трансформации (комбинированный) При этом чужеродная ДНК вводится в ткани каким-либо физическим методом, например, баллистическим. Вводимая ДНК включает как вектор с целевым и маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности, поставленные под эукариотический промотор. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном, как и при обычной агробактериальной трансформации.
5) ДНК-инсерционный мутагенез. Т-ДНК, встраиваясь в геном растения, выключает ген, в который она встроилась, а по утрате функции можно легко отбирать мутанты, используя явление сайлесинга – замолкания генов. На основе Т-ДНК мутагенеза получены растения томатов с неспецифической устойчивостью к фитофторозу, а также трансгенные растения с измененными декоративными свойствами (растений петунии с разноцветными цветками), голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума.
После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит селективный агент, в отношении которого трансгенные, но не контрольные клетки приобретают устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.
