Иммуноэлектрофорез

В те же 40-е гг. XX в. биохимики научились проводить электрофоретическое разделение белков в гелевых средах. В 1953 г. П. Грабар и К. Уиллиамс (P. Grabar, C.S. Williams) предложили методику иммуноэлектрофореза, которая фактически представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белковых смесей и метода Оухтерлони и Элека. В геле с одного края пластины пробивают ряд из несколько лунок, в которые вносят исследуемые на содержание тех или иных интересующих белков растворы или сыворотки пациентов. К пластине с гелем прикладывают электрическое поле и проводят электрофорез. По завершении электрофореза в геле в центре пластины вырезают канавку, параллельную направлению движения белков в электрическом поле. В эту канавку вносят антисыворотку или смесь антител против искомых белков и оставляют на 16-24 ч

для диффузии, после чего регистрируют образующиеся полосы преципитации. Число полос преципитации показывает, к какому количеству компонентов, находящихся в биопробе, в антисыворотке есть комплементарные антитела. Если при электрофорезе использовать калибраторы, т.е. известные белки в достаточных концентрациях, то сравнение полос преципитации материала из биопроб с полосами преципитации с калибровочными белками может стать доказательством наличия в испытуемом материале конкретного белка(ов).

Существует множество модификаций метода иммуноэлектрофореза. На рис. 4.3 проиллюстрировн наиболее простой и употребляемый вариант.

Рис. 4.3. Схема иммуноэлектрофореза по Грабару и Уиллиамсу: а - схема установки; б - результаты электрофореза

В стартовые лунки для электрофореза внесены сыворотки крови двух пациентов - 1 и 2, в канавку в центре пластины по завершении электрофореза проб сывороток внесена смесь антисывороток против основных фракций сывороточных белков - альбуминов, α-, β- и γ-глобулинов. После диффузии сыворотки-1 видны дуги преципитации со всеми основными фракциями сывороточных белков, в том числе с иммуноглобулинами. В сыворотке пациента 2 гамма-глобулины отсутствуют. На основании данных электрофореза пациенту 2 поставлен диагноз агаммаглобулинемии.

«Ракетный» иммуноэлектрофорез

Если к гелю на стеклах, полностью подготовленных для выполнения метода радиальной иммунодиффузии, приложить электрическое поле, то движение компонентов сывороток, в том числе иммуноглобулинов, из лунок в толщу геля будет происходить не в режиме спонтанной диффузии, а в принудительном режиме по силовым линиям электрического поля, что существенно ускоряет процесс. В результате преципитаты станут видны уже примерно через 1 ч, но будут иметь форму не колец, а вытянутых пиков, напоминающих летательные аппараты - ракеты. Такую модификацию метода иммунодиффузии называют «ракетным» иммуноэлектрофорезом. Внешний вид результатов «ракетного» иммуноэлектрофореза показан на рис. 4.4.

Рис. 4.4. «Ракетный» иммуноэлектрофорез: 1 - пациент с агаммаглобулинемией; 2, 3, 4 - калибровочные растворы иммуноглобулинов; 5 - пациент с гипергаммаглобулинемией (возможна миеломная болезнь)

В настоящее время во многих лабораториях изотипы иммуноглобулинов определяют нефелометрическим методом. Специфическими реагентами служат моноклональные антиизотипические антитела. Количество иммунных комплексов оценивают на приборе нефелометре. Калибровку и расчет результатов осуществляют с помощью программного обеспечения.