Гибридизация

Гибридизация in situ. В ходе дифференцировки клеток координированно включаются и выключаются большие группы генов. Гибридизация одноцепочечной молекулы ДНК (ДНК–зонд) с комплементарной информационнойРНК позволяет ответить на вопрос, присутствует или нет в ткани ген-мишень, происходит или нет экспрессия этого гена, и установить уровень, на котором она может меняться — транскрипция ДНК, сплайсинг РНК, трансляция (рис.1-12). Метод гибридизации in situ позволяет выявить нужные последовательности ДНК или РНК (например, вирусной, бактериальной, грибковой или протозойной в инфицированной ткани). Последовательности нуклеиновых кислот, связанные с меткой (радиоактивный ³²P; биотин, характеризующийся высоким сродством к авидину), находят комплементарную последовательность в клетке. Таким образом, метод гибридизации in situ даёт возможность выявлять гены (рис. 1-12А), изучать их экспрессию и локализовать место трансляции.

Рис. 1-12. Гибридизация in situ. ДНК–зонд связывается с комплементарным участком информационной РНК в исследуемом образце. Визуализация связанного с меткой ДНК–зонда указывает на экспрессию гена-мишени в конкретном клеточном типе. [99]

Рис. 1-12А. Гибридизация in situ. Стрелками указаны участки локализации Y‑хромосомы, ДНК–зонд: ген sry. Свежезамороженный срез.

Матричная гибридизация. Метод основан на технологии гибридизации ген-специфичных олигонуклеотидных ДНК–проб (20–25 нуклеотидов), иммобилизованных в матрицу биологических микрочипов (биочипов), с комплементарной ДНК (кДНК) исследуемого материала. Суммарную РНК экстрагируют из данного материала и с помощью обратной транскриптазы синтезируют кДНК в присутствии флюоресцентной или радиоактивной метки. Результаты гибридизации анализируют с помощью устройств, регистрирующих флюоресценцию или радиоактивность и сопутствующей компьютерной программы. Метод позволяет параллельно анализировать неограниченное число известных генов, поскольку количество иммобилизованных ДНК–проб в биочипе может варьировать от нескольких десятков до нескольких тысяч. В настоящее время доступны биочипы, содержащие десятки тысяч ДНК–проб, синтезированных на основе документированных генов человека. В онкологии практическое применение получили биочипы для диагностики и прогнозирования злокачественных опухолей молочной железы, толстой кишки, предстательной железы, поджелудочной железы, лейкозов, лимфом.