2015-04-23
1041
Излучение лазера на красителях с длиной волны 620 нм фокусируют при помощи оптики микроскопа в виде пятна диаметром 10 мкм. Предварительно ткань обрабатывают АТ, связанными с красителем (хромофором) малахитовым зеленым. АТ избирательно взаимодействуют с белком-мишенью. В результате в непосредственной близости с этим белком оказывается краситель, который аккумулирует энергию лазерного излучения. При этом образуются короткоживущие и повреждающие белок гидроксильные радикалы. Методика позволяет избирательно блокировать функцию конкретных белков в клетке и таким образом устанавливать их роль. При выключении подобным образом функции тех или иных белков оказывается возможным наблюдать поведение клеток в реальном времени. Особенно перспективным представляется использование данного метода для описания функции белков, связанных с цитоскелетом, молекулярными моторами, удлинением частей клетки, образованием их отростков, например, формированием конуса роста аксона, а также роли интегральных и периферических мембранных белков.
МЕТОДЫ ГЕННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ
Генное зондирование позволяет выявить специфические нуклеотидные последовательности ДНК и РНК в исследуемом объекте (биологическая жидкость, биопсия, гистологический срез, мазок). В основе метода лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации по правилу Уотсона–Крика (A-T и G-C), т.е. к комплементарному спариванию нуклеотидов искомой ДНК (или РНК) с олигонуклеотидным зондом, имеющим специфическую последовательность оснований. В состав зонда во время синтеза олигонуклеотида вводят специальную метку (радиоактивные изотопы, флюоресцеины, биотин), позволяющую обнаружить образующиеся двухцепочечные комплексы.
Саузерн-блот (Southern blot)
С помощью ДНК–зонда производят поиск идентичных участков ДНК в исследуемом образце. Пробы ДНК обрабатывают рестрицирующими нуклеазами, а полученные фрагменты ДНК разделяют по размеру (пар нуклеотидов) с помощью электрофореза в агарозном геле. Затем образцы нуклеиновых кислот с геля переносят на нитроцеллюлёзную или нейлоновую мембрану (блотинг), на которой гибридизируют искомую ДНК с ДНК–зондом. Метод визуализации двухцепочечных комплексов зависит от типа метки ДНК–зонда. Положительная реакция гибридизации указывает на присутствие искомого фрагмента ДНК в данном образце.
