Методы создания клеточных культур растений

Идея возможности культивирования клеток вне организма была высказана еще в конце XIX в. Период с 1892 по 1902 г. можно считать предысторией развития метода культуры клеток и тканей растений. В этовремя немецкие ученые Х. Фехтинг, Г. Габерландт предпринимали попытки выращивать изолированные из растений кусочкитканей, группы клеток, волоски. Не достигнув экспериментальных успехов, эти первые исследователи, однако, высказали ряд идей, реализованных позднее.

Основным типом культивируемой растительной клетки являетсякаллусная. В биотехнологии каллусом называют недифференцированные клетки, являющиеся тотипотентными и способными поэтому дать начало целому растению. Каллусные клетки в пересадочной культуре могут спонтанно приобрести гормононезависимость. Природа такой независимости к ауксину ицитокинину, чаще всего применяемым при выращивании клеточныхкультур растений, может быть генетической (результат мутации) илиэпигенетической (результат экспрессии генов, определяющих гормоно-независимость клетки). При генетической гормононезависимости каллусные клетки ведут себя как опухолевые, при эпигенетической они теряют признак в ряду превращений клетка − растение − клетка.Каллусная клетка, в результате деления которой возникает каллусная ткань, или каллус, представляет один из типов клеточнойдифференцировки, присущей высшему растению. Для растения каллус является тканью, возникающей при исключительных обстоятельствах (обычно при травмах) и функционирующей непродолжительноевремя. Эта ткань защищает травмированное место, накапливает питательные вещества для анатомической регенерации или генерации утраченного органа.

Для получения культивируемых каллусных клеток in vitro фрагментытканей разных органов высших растений (экспланты) помещают на искусственную питательную среду в пробирки, колбы, чашки Петри. Процесс получения первичного каллуса и поддержание пересадочной культуры требует строго стерильных условий. Для этого с помощью стерильных растворов, содержащих хлор или ртуть (гипохлориты, сулема, диацид), к которым для лучшего смачивания добавлены детергенты, стерилизуют экспланты, тщательно отмывая их затем от используемого раствора стерильной водой. Питательные среды, растворы, инструменты,материалы, необходимые для работы, стерилизуют в автоклавах или сухожаровых шкафах. Все манипуляции с культурами проводят в микробиологических боксах, облучаемых перед работой ультрафиолетом, илиламинар-боксах, где стерильность достигается постоянной подачей стерильного воздуха в рабочий объем.

В готовящейся к делению клетке стимулируется синтез всех типовРНК, исчезают ткане специфические белки-антигены и появляются белки, специфичные для делящихся клеток и каллусной ткани. Это свидетельствует об изменении активности генов и белкового аппарата клетокпри дедифференцировке.

Образование каллуса не во всех случаях связано с травматическимвоздействием. Каллус может возникнуть в результате пролиферациивнутренних тканей экспланта без связи с поверхностью среза. Растущийкаллус разрывает слои ткани и развивается на поверхности. Образованиекаллуса при эксплантировании фрагмента ткани в условиях in vitro свойственно двудольным и однодольным покрытосеменным и голосеменнымрастениям, папоротникам, мхам, печеночникам.