Ферменты

Важнейшую роль в обмене веществ и трансфор­мации энергии в клетке играют биологические ката­лизаторы белковой природы — ферменты.

Все ферменты по своей химической природе раз­деляются на два больших класса:

— однокомпонентные

— двухкомпонентные.

Первые состоят исключительно из белка. В моле­куле вторых кроме белка имеется небелковая часть. Белковая часть двухкомпонентного фермента носит название апофермента, а небелковая — кофермента. В качестве коферментов выступают, прежде всего, ви­тамины В₁, В₂ и их различные производные, витамин В₆, никотиновая кислота и др., а также металлы (железо, медь, кобальт, марганец и др.).

По месту расположения ферменты делятся на три группы:

эндоферменты. Действуют в клетке, где образовались;

эктоферменты. Участвуют в процессах на цитоплазматической мембране;

экзоферменты. Синтезируются в клетке, выделя­ются из нее и осуществляют свою работу вне цитоплазматической мембраны, снаружи от нее.
Высшим растениям более всего присущи ферменты первой группы. Так, ферменты фотосинтеза расположе­ны в хлоропластах, дыхания — в митохондриях и т.д.

Ферменты второй и третьей групп особенно боль­шое распространение получили в мире микроорганиз­мов. Они действуют главным образом в субстрате, на котором поселяются микробы. Поэтому их нередко называют внеклеточными ферментами. Однако и у высших растений наблюдается выделение ферментов из клеток, например из корня — в прикорневую зону (ризосферу) или из щитка зародыша злаков — в эндос­перм. Выделению ферментов клетками корней неред­ко способствуют неблагоприятные внешние условия (анаэробиоз и др.).

Ферменты отличаются следующими общими особенностями:

— большой каталитической активностью, значительно более высокой, чем у неорганических ката­лизаторов (напомним, что катализ — это явление изменения скорости химической реакции или ее возбуждения с помощью катализаторов, химический состав которых и их количество после реакции остаются неизменными);

— специфичностью действия, под которой понимается способность фермента реагировать только с определенными веществами (субстратами) и действовать только на определенные химические связи; иначе эту особенность называют субстратной специфичностью фермента;

— лабильностью, т. е. способностью изменять скорость реакции в зависимости от действия ряда внешних и внутренних условий;

— обратимостью действия — способностью катализировать взаимопротивоположную направленность хода реакции; эта особенность присуща далеко не всем ферментам.

Важной характеристикой любого фермента явля­ется константа Михаэлиса. Под этой константой по­нимается такая концентрация субстрата, при которой скорость ферментативной реакции составляет полови­ну от возможно максимальной концентрации. При малых количествах субстрата скорость фермен­тативной реакции пропорциональна его концентра­ции. С возрастанием концентрации субстрата ход реакции ускоряется все в меньшей и меньшей степе­ни, а затем становится независимой от нее (выход кривой на плато) и будет уже определяться концент­рацией фермента.

В живой клетке наряду с химической энергией (АТФ) имеется и другой источник унифицированной энергии — физическая (электрическая), которая носит название мембранного потенциала. Он представляет собой разность электрических потенциалов между цитоплазмой клетки и внеклеточной жидкостью.

По современным представлениям, химическая ре­акция может произойти только тогда, когда молекулы реагирующих веществ будут активированы, т. е. будут

Рис. 1.3. Влияние концентрации субстрата на скорость

реакции, катализируемой ферментом:

С — концентрация субстрата; V — скорость реакции;

У_макс — максимальная скорость реакции;

К_м — константа Михаэлиса

иметь определенное дополнительное количество энер­гии. Без катализатора таких активированных молекул немного и реакции протекают очень медленно. При добавлении катализатора энергия активации, при кото­рой начинается реакция, понижается, а число молекул, которые способны вступить в реакцию, увеличивается. Вместе с этим возрастает и число столкновений моле­кул между собой, скорость реакции увеличивается. Катализатор снижает энергию активации за счет обход­ных, дополнительных путей, через ряд промежуточных процессов, требующих меньшее количество энергии. Ниже приводится иллюстрация сказанному.

Реакция распада вещества АВ на А и В без катали­затора записывается так:

АВ→А+В.

С катализатором (К) та же реакция будет прохо­дить в несколько этапов:

1) АВ + К→АВК; 2) АВК→ВК + А; 3)ВК→В + К.

Катализатор снова регенерируется в неизменном виде, а промежуточные реакции, проходя с меньшей затратой энергии, идут быстро, и, следовательно, скорость суммарной реакции АВ → А+ В значительно возрастает. Так, при гидролизе сахарозы на глюкозу и фруктозу без катализатора энергия активации равна 134,4 кДж/моль, с неорганическим катализатором (ион Н⁺) — 107,3, а с ферментом сахаразой — всего 39,5 кДж/моль.

Во взаимодействие с субстратом вступает часть молекулы фермента, получившая название активно­го центра. Фермент несколько деформирует молеку­лу субстрата с образованием фермент-субстратного комплекса. Эта деформация ослабляет внутримоле­кулярные связи в субстрате и делает его молекулу способной вступать в реакцию. На активный центр фермента сильное влияние оказывают специфичес­кие активаторы и ингибиторы, ускоряющие или за­медляющие его действие. Есть также ингибиторы и активаторы, присоединяющиеся не к активному цен­тру фермента, а к другой его части. При этом изме­няется структура молекулы в результате вращения атомов или групп атомов вокруг простых связей, а сле­довательно, и структура активного центра. В резуль­тате этих конформационных перестроек происходит ослабление или усиление активности фермента. Уча­сток молекулы фермента, к которому присоединяют­ся ингибиторы или активаторы (эффекторы), вызыва­ющие изменение структуры активного центра, носит название аллостерического центра.

На скорость ферментативных реакций наиболее сильное влияние из внешних факторов оказывают тем­пература и рН среды.

С повышением температуры до определенных значений скорость ферментативной реакции возрас­тает, затем, достигнув максимальной величины, начи­нает падать. Для большинства ферментов это 40 — 50°С. Начиная с 50°С и выше скорость ферментативной ре­акции снижается из-за потери активности фермента вследствие нарушения структуры белка, его денатура­ции. При этом восстановление активности с наступле­нием в последующем оптимальной температуры не происходит в отличие от действия пониженных темпе­ратур, когда перенесение тканей в условия с благопри­ятной температурой восстанавливает свойственную ферментам активность.

Сопоставление скоростей ферментативных и химических реакций при изменении температуры показывает — до момента достижения максимальной скорости работы фермента зависимость скорости химической реакции одинакова с фермента­тивной, а затем первая продолжает повышаться, в то время как ферментативная из-за денатурации белка ферментов резко падает.

Большинство ферментов полностью инактивируется при температуре 60°С. Встречаются и довольно ус­тойчивые ферменты, например рибонуклеаза или пероксидаза хрена. После промораживания активность ферментов восстанавливается, поэтому в заморожен­ном состоянии можно достаточно долго хранить фер­менты вне клетки. В целом белки-ферменты более ус­тойчивы к температуре, чем структурные белки цито­плазмы.

Значительная часть ферментов действует с наиболь­шей скоростью при реакции среды слабокислой или близкой к нейтральной. Вместе с тем, почти каждый фермент имеет свои кардинальные точки рН среды. Поэтому кислотность внутри клетки является одним из важнейших факторов регуляции обмена веществ.

На скорость ферментативных реакций оказыва­ют также влияние концентрация ионов, окислитель­но-восстановительный потенциал и другие факторы.

В природе существует огромное количество не только отдельных ферментов, но и ферментных сис­тем. Список ферментов 1972 г. уже содержал более 2000 наименований. Примерно двести из них получе­ны в кристаллическом виде. Для сотен из них выясне­ны различные структуры. Для каждого фермента оп­ределено название, исходя из его основной функции, и присвоены кодовые числа и шифры. Шифр каждого фермента содержит четыре числа, разделенных точка­ми, и составлен по следующему принципу: первое число указывает класс фермента, второе — подкласс, третье — подподкласс, четвертое — порядок фермента в подпод-классе.

В основу классификации ферментов положена природа химических превращений, тип реакций, ката­лизируемых ферментами. По этим признакам все мно­гообразие ферментов раздельно на шесть классов: оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные фер­менты); трансферазы; гидролазы (гидролитические ферменты); лиазы; изомеразы; лигазы (синтетазы).

1. К оксидоредуктазам относятся ферменты, ката­лизирующие реакции окисления и восстановления. Они переносят протон или электрон от одного субстрата к другому, окисляя первый и восстанавливая второй. Эти ферменты участвуют во всех процессах биологическо­го окисления — дыхания и брожения. Схему действия оксидоредуктаз можно изобразить следующим образом: RH₂ + A ↔ R-+AH₂ или R- + A ↔ R+A.

Из этого класса ферментов особо следует выделить дегидрогеназы, катализирующие реакции отщепления водорода от одного вещества и перенос его к другому. Первое вещество в данном случае называется донором водорода, а второе — акцептором его. Дегидрогеназы разделяют на флавиновые и пиридиновые.

— Пиридиновые дегидрогеназы. Их называют анаэ­робными, так как они непосредственно кислороду передавать водород не могут.

Коферментами пиридиновых дегидрогеназ являют­ся никотинамидадениндинуклеотид-фосфат (НАДФ) и никотинамидадениндинуклеотид [НАД]. НАД представляет собой динуклеотид, состоящий из азотистого ос­нования аденина, амида никотиновой кислоты (вита­мина РР), двух молекул сахара рибозы и двух остатков фосфорной кислоты. НАДФ отличается от НАД присут­ствием третьего остатка фосфорной кислоты. Со сво­им апоферментом они связаны только в момент осуще­ствления реакции дегидрирования. Одни дегидрогеназы содержат только НАДФ, другие — НАД, т. е. эти коферменты не могут замещать друг друга.

Взаимодействуя с субстратом, дегидрогеназы от­нимают от него два иона водорода и два электрона. Способностью обратимо присоединять протоны и элек­троны обладают их коферменты. Например, НАДФ переходит в восстановленную форму — НАДФ Н + Н⁺ (сокращенно НАДФН₂). Подобной же способностью обладает и НАД, также переходящий в восстановлен­ную форму — НАДН + Н+ (сокращенно НАДН₂).

Примерами анаэробных дегидрогеназ можно на­звать малатдегидрогеназу (КФ 1.1.1.37), катализиру­ющую превращение яблочной кислоты в щавелево-уксусную, и алкогольдегидрогеназу (КФ 1.1.1.1), пре­вращающую этиловый спирт (этанол) в уксусный альдегид.

— Флавиновые дегидрогеназы. Их называют еще аэробными дегидрогеназами, ибо они могут пе­редавать отнятый от донора водород кислороду воздуха.

Коферментами флавиновых дегидрогеназ являют­ся флавинадениндинуклеотид (ФАД) и флавинмононуклеотид (ФМН). ФАД и ФМН являются нуклеотидами, содержащими пятиутлеродный спирт D-рибит (рибитол) и азотистое основание рибофлавин (витамин В₂), обладающий способностью обратимого присоединения водорода. В составе ФАД находятся два нуклеотида, один из которых содержит остатки D — рибита, фос­форной кислоты и флавина, другой — остатки адени­на, рибозы и фосфорной кислоты. Состав ФМН пред­ставлен D — рибитом, остатком фосфорной кислоты и флавином. Восстановленная форма ФАД обозначается как ФАДН₂, а ФМН — ФМНН₂. Со своим апофермен­том флавиновые коферменты связаны значительно прочнее, чем пиридиновые. Другим отличием флави­новых дегидрогеназ является наличие в составе их апоферментов металлов (железа, марганца, меди, мо­либдена).

Представителями аэробных дегидрогеназ являют­ся оксидазы, для которых акцептором водорода слу­жит исключительно кислород воздуха. Отщепляя во­дород от окисляемого вещества АН₂ и передавая его кислороду, оксидаза образует воду или перекись во­дорода: АН₂ + О₂ → А + Н₂О₂. Среди оксидаз в рас­тительном мире широкое распространение получили полифенолоксидаза (КФ 1.10.3.1) и аскорбатоксидаза (КФ 1.10.3.3). Обе представлены белком, содержащим в качестве кофермента медь. Первая окисляет дифенолы С₆Н₄(ОН)₂, вторая превращает аскорбиновую кислоту в дегидроаскорбиновую. Важную роль в жиз­ни растений выполняет цитохромоксидаза (КФ 1.9.3.1), которая активирует молекулярный кислород, перенося на него электроны от цитохромной системы.

Нельзя не отметить и пероксидазу (КФ 1.11.1.7), осуществляющую окисление органических веществ с помощью перекиси водорода, с которой она обра­зует комплексное соединение и приобретает способ­ность быть акцептором водорода. Пероксидаза ши­роко распространена в мире растений и играет важ­ную роль в превращении полифенолов и арома­тических аминов.

К классу оксидоредуктаз относят и фермент каталазу (КФ 1.11.1.6), осуществляющую расщепление пе­рекиси водорода на воду и молекулярный кислород: 2Н₂О₂ → 2Н₂О + О₂. Физиологическая роль каталазы состоит, прежде всего, в том, что она предотвращает накопление значительных количеств перекиси водоро­да, так как последняя ядовита для клеток.

2. Трансферазы — ферменты, катализирующие реакции переноса химических групп между молекулами веществ: метальные (метпилтрансферазы), аминные (аминотрансферазы), фосфатные (фосфотрансферазы) и многие другие. Фосфотрансферазы, для которых до­нором фосфатных групп служит АТФ, называются киназами. Схема действия всех трансфераз:

RX + A↔ R + AX.

3. Гидролазы катализируют реакции гидролитического, т. е. с участием воды, распада веществ:Этот класс делится на подклассы:

— эстеразы — ферменты, расщепляющие сложные эфиры (липазы, фосфатазы и др.);

— карбогидразы — катализируют реакции гидролиза сложных углеводов (амилаза, малыпаза, сахараза и др.);

— пептидогидролазы (протеазы или пептидазы) —участвуют в расщеплении пептидной связи в белках (СО-NH).

4. Лиазы — ферменты, катализирующие реакции расщепления веществ без участия воды, т. е. негидролитическим путем, а также присоединения функциональных групп по двойным связям: R₁R₂→ R₁+R₂

В частности, для декарбоксилаз — ферментов, отщепляющих СО₂, эту реакцию можно записать таким образом: R-COOH →RH + СО₂.

Так, например, фермент пируватдекарбоксилаза (КФ 4.1.1.1) отщепляет молекулу углекислоты от пировиноградной кислоты с образованием уксусного альдегида: СН₃-СО-СООН→СН₃-СНО + СО₂.

5. Ферменты, катализирующие процессы изомеризации, — изомеразы осуществляют реакции превращения веществ в их изомеры. Например, рибозофосфат-изомераза (КФ 5.3.1.6) превращает рибозо-5-фосфат в рибулозо-5-фосфат; триозофосфат-изомераза (КФ5.3.1.1) осуществляет превращение фосфоглицеринового альдегида в диоксиацетонфосфат.

6. Лигазы, или синтетазы, осуществляют реакции синтеза разнообразных веществ. Известно, что все синтетические процессы требуют затраты энергии и поэтому протекают только при участии АТФ:

R¹ + R² + АТФ → R¹R² + АДФ + Н₃РО₄.

Например, пируваткарбоксилаза (КФ 6.4.1.1) осу­ществляет реакцию синтеза щавелево-уксусной кисло­ты из пировиноградной кислоты и СО₂:

СН₃ - СО - СООН + СО₂ + АТФ + Н₂О → СООН - СО - СН₂ - СООН + АДФ + Н₃РО₄. В данном классе следует отметить и ферменты, участвующие в реакциях присоединения остатков аминокислот к транспортной РНК в процессе син­теза белка. Так, под действием аланил-тРНК-синте-тазы (КФ 6.1.1.7) образуется комплекс аланина и тРНК:

АТФ + аланин + тРНК → аланин-тРНК + АМФ (аденозинмонофосфат) + Н₂РО₄