Методы почвенной микробиологии

В микробиологии существует целый ряд методов изучения, культивирования и учета микроорганизмов. Разнообразие методов связано не только с наличием различных экологических групп микроорганизмов, но и с чрезвычайно большим разнообразием способов питания, путей метаболизма представителей микроскопического мира существ, превращения исходных про­дуктов и субстратов, а также со специфическими по­требностями отдельных видов микроорганизмов в оп­ределенных веществах (факторах роста), которых они сами не могут синтезировать.

По способу питания микроорганизмы делятся на:

1. гетеротрофов, использующих готовое органическое вещество (их большинство),

2. автотрофов, способных самостоятельно синтезировать органические вещества из неорганических веществ.

По отношению к молекулярному кислороду мир микроорганизмов делится на:

1. аэробов, живущих и размножающихся только вприсутствии О₂;

2. анаэробов, способных жить в бескислородной среде.
Различаются микроорганизмы и по их отношению к температуре и рН среды.

В зависимости от различного отношения микроор­ганизмов к пище и экологическим факторам для их культивирования приготавливают синтетические пита­тельные среды или используют естественные (молоко, сыворотку крови, картофель, различные соки растений и др.), а также мясопептонный бульон, пивное сусло, вытяжки из почвы, торфа и т. д. Из синтетических сред широко используются определенные наборы хими­ческих веществ, в том числе минеральных для авто­трофов. Среды могут быть жидкими или плотными с добавлением 2 % агар-агара или 20 % желатины.

Аэробов культивируют на стерильной плотной или жидкой питательной среде. В последнем случае используют постоянное аэрирование — продувание стериль­ного воздуха или встряхивание на специальных качал­ках. Среда для анаэробов кипятится и сверху залива­ется не пропускающим воздух маслом или помещается в специальные камеры — анаэростаты с выкаченным воздухом.

Для изучения и количественного учета почвенных микроорганизмов используют лабораторные и полевые методы.

I. Отбор проб для лабораторных исследований на­чинается со стерилизации инструментов, при помощи которых берется проба почвы, посуды, в которой эти пробы доставляются в лабораторию, и питательных сред.

Существуют следующие виды стерилизации:

— сухим жаром при температуре 160°С в течение 2 -3 часов (ножи, иглы, скальпели и другие инструменты, посуда) или прокаливанием в пламени горелки (иглы, петли, горлышки колб, пробирок и др.);

— автоклавированием в герметически закрываемой камере при 120°С в течение не менее 20 минут горячим паром под давлением;

— текучим паром при температуре 100°С однократной обработкой не менее 30 минут или путем дробной стерилизации (повторно через сутки) для того, чтобы убить проросшие споры у спорообразующих бактерий;

— фильтрованием через мембранные фильтры из асбеста с целлюлозой или из эфиров целлюлозы; такие фильтры вставляют в колбы (все, естественно, должно быть стерильным) и через них фильтруют жидкость, содержащую микроорганизмы, которые задерживаются на фильтре, а полученный фильтрат оказывается стерильным;

— облучение ультрафиолетовыми лучами или гамма-лучами.

Для изучения микроорганизмов используют чистые и накопительные культуры. В природных условиях микроорганизмы находятся в сложных сообществах, обычно состоящих из многочисленных популяций раз­ных видов. В таких сообществах изучать физиологичес­кие особенности, рост и развитие отдельных видов очень трудно или просто невозможно.

Чистая культура — выращивание одного вида микроорганизма. Такая культура получается в несколь­ко этапов. Делается это в основном двумя методами:

— разведением. При разведении небольшую навеску почвы разводят в сотни тысяч раз стерильной водой, а затем небольшое количество полученного фильтрата высевают на плотную среду и из выросших колоний выделяют чистые культуры.

— капиллярным. Более точный метод получения чистой культуры основан на использовании капилляров. В разведенный фильтрат опускают капилляры с плоскопараллельными стенками и под микроскопом находят то место, где расположена одна микробная клетка. Она затем высевается на стерильную среду.

В дальнейшем создаются благоприятные для дан­ного вида условия: оптимальная температура, аэрация (или отсутствие О₂ для анаэробов), рН среды и т. д. Принимаются меры для предохранения полученной культуры от заражения другими видами микроорганиз­мов. Культура постоянно проверяется на однородность.

Чистые культуры в почвенной микробиологии ис­пользуются редко, так как по активности микроорга­низма в чистой культуре трудно судить об его активно­сти в природной обстановке поля, леса, луга и т. д., где он находится в тесном взаимодействии и взаимной связи с другими организмами.

Накопительной культурой называют такую куль­туру, в которой резко преобладает один или несколь­ко близких видов микроорганизмов. Она получается путем посева материала с присутствием интересую­щего вида на элективную среду, благоприятную для данного вида или группы видов, и чуждую — для других. Например, берут комочек почвы, в котором, как известно, присутствует множество видов микро­бов, и помещают в среду, не содержащую азота. Есте­ственно, на безазотистой среде могут расти и разви­ваться только такие микроорганизмы, которые способ­ны добывать молекулярный азот из атмосферы, так называемые азотфиксаторы. Через некоторое время другие микроорганизмы погибнут или будут влачить жалкое существование, а азотфиксирующие — про­цветать. Для количественного и качественного учета мик­роорганизмов почвы в лабораторных условиях исполь­зуют:

1.Посевы на плотную питательную среду предусматривают разведение навески почвы дистиллированной стерильной водой обычно в 100 000 раз; из полученной болтушки берется небольшое количество жидкости (1 мл) и наносится на плотную питательную среду. Через 3 — 7 суток на поверхности среды вырастают несколько десятков или сотен колоний. Данный метод дает заниженные результаты, так как питательные среды не могут быть универсальными для всех организмов. Питательную среду в данном случае лучше приготавливать на почвенной вытяжке, предварительно простерилизованной.

2.Метод прямого микроскопирования заключается в непосредственном подсчете под микроскопом числа микроорганизмов в капле почвенной суспензии, предварительно нанесенной на чистое стерильное и обезжиренное предметное стекло, зафиксированной после размазывания над пламенем горелки и окрашенной соответствующим реактивом (карболовым фуксином и др.). При использовании люминесцентного микроскопа мазок с микроорганизмами окрашивается флуорохромом акридином оранжевым. Живые микроорганизмы в ультрафиолете светятся зеленым, а мертвые — красным светом. Этот метод наиболее точный.

Из лабораторных методов определения физиологи­ческой активности почвенных микроорганизмов сле­дует назвать учет выделяемой в процессе дыхания или брожения микроорганизмами СО₂, накопления нитра­тов в среде с аммонийными формами азота (нитрифи­цирующая способность), активности различных фер­ментов, выделяемых микроорганизмами, и некоторые другие. Выделяющаяся при использовании первого метода СО₂ из почвенных образцов, помещенных в гер­метически закрытые колбы, поглощается раствором барита, избыток которого оттитровывается кислотой, обычно соляной. Нитрифицирующую способность оп­ределяют с использованием накопительной культуры со средой С.Н. Виноградского. Стерилизованные колбы со средой засеваются комочками почвы и помещаются в термостат с температурой 25 — 30 °С на 5 — 6 дней.

Наличие азотной и азотистой кислот определяют одним из количественных или качественных методов. Из последних чаще всего используется метод обнару­жения азотной кислоты с помощью реакции с дефиниламином в крепкой серной кислоте: синее окрашива­ние при смешивании реактива с каплей жидкости из накопительной культуры будет свидетельствовать о наличии иона NO₃-. Азотистая кислота обнаруживает­ся с помощью реактива Грисса, с которым она дает красное окрашивание.

Ферментативную активность аэробных целлюлозоразрушающих микроорганизмов можно опреде­лить несколькими методами. Один из них, самый простой, заключается в следующем. Обогащенную KNO₃ навеску почвы увлажняют и помещают в чаш­ку Петри, на дно которой кладут стерильные обеззоленные фильтры. На поверхность почвы, уложенной в виде тонкой пластинки, накладывают фильтроваль­ную бумагу и плотно прижимают ее к поверхности почвенной пластинки. Приготовленные таким обра­зом образцы помещают во влажные камеры на раз­личное время в зависимости от свойств почвы (обыч­но несколько недель и более). По характеру и степени разложения бумаги судят об активности внеклеточных ферментов целлюлозоразрушающих микроорганиз­мов. Подобным образом можно изучать активность других групп микроорганизмов, например пектин- или лигнинразрушающих.

II. Непосредственно в природной обстановке, в том числе в лесу, используют полевые методы учета коли­чества или активности микроорганизмов:

1.Одним из широко распространенных полевых методов является метод стекол обрастания (по Н.Г. Холодному). На стерильные стекла наносят твердую питательную смесь, например крахмало-аммиачный агар, и закапывают их на глубину 3 — 5 см. Через некоторое время на среде появляются колонии характерных для данной почвы микроорганизмов.

2.Большой интерес представляет метод капиллярных педоскопов Б.В. Перфильева и Д.Р. Габе. Приготавливается набор капиллярных ячеек с прямоугольными каналами. Капилляры заполняют полужидкой агаризованной средой с добавлением перегнойных фульвокислот, составных частей гумуса почвы. Приго­товленные таким образом капилляры закапывают в почву на 1,5 — 2 месяца. В капилляры проникают и раз­виваются характерные для того или иного генетичес­кого горизонта почв сообщества микроорганизмы.

3. Часто микробиологи, занимающиеся изучением почвенных микроорганизмов, используют метод апп­ликаций, который учитывает микробиологическую ак­тивность почвы и отдельных представителей почвен­ного микромира. Для этого полоски бумаги, состоящие, как известно, из целлюлозы или хлопчатобумажного полотна, закрепляют на стекле и закапывают в почву на определенную глубину на срок до трех месяцев. Микробиологическая активность, в данном случае целлюлозоразрушающих микроорганизмов, оценивается по скорости разложения целлюлозы (количеству раз­рушенной ткани или бумаги).

ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ПРОКАРИОТНЫХ ОРГАНИЗМОВ

В жизни высших растений микроорганизмы раз­личных систематических групп имеют неравноценное значение. Наибольшая роль принадлежит прокариотам.

Клетка прокариот сравнительно с клетками расте­ний характеризуется рядом структурных и функциональ­ных особенностей, которые сводятся к следующему:

—отсутствие ядерной оболочки и оформленного ядра;

—отсутствие обособленных от цитоплазмы органелл;

—слабое развитие мембран: у большинства прокариотных клеток цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) является единственной;

—особое строение клеточной стенки.

Большинство бактерий является одноклеточными организмами. Эволюция выработала у них такие адап­тивные механизмы, которые позволяют каждой отдель­ной клетке осуществлять все необходимые жизненные функции, рост, развитие и размножение.

Бактериальная клетка содержит до 80% воды. Ос­тальная часть представлена белками, полисахаридами, липидами, нуклеиновыми кислотами. В сухом веществе клетки они соответственно составляют в среднем 52, 17, 9 и 19 %.

Ультрамикроскопическое строение метки бактерий показано на рис. 5.3. Цитоплазму, окруженную мембраной, называют протопластом. Снаружи от ЦПМ располагаются поверхностные структуры прокариотной клетки: клеточная стенка, слизистые капсулы или чехлы, жгутики, ворсинки.

В связи с особенностями строения клеточной стен­ки бактерии делят на грамположительные и грамотрицательные. Название происходит от способа окраши­вания, предложенного датским ученым X. Грамом: фиксированные клетки бактерий обрабатывают снача­ла реактивом кристаллическим фиолетовым, затем йодом, вследствие чего появляется специфическое окрашивание. При последующей обработке этиловым спиртом у одних бактерий окрашивание исчезает — это грамотрицательные бактерии. Другие бактерии сохраняют окрашенный комплекс, поэтому получили название грамположительных бактерий.

Клеточная стенка прокариот устроена очень слож­но. Основная масса клеточной стенки грамположительных бактерий состоит из гетерополимерного соединения — пептидогликана, остов молекулы которого пред­ставлен чередующимися остатками N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты. Последняя является эфиром N-ацетилглюкозамина и молочной кис­лоты, к карбоксильной группе которой присоединен пептидный «хвост» из нескольких аминокислот, обычно четырех (рис. 5.4.). Эта пептидная цепочка необычна по двум причинам. Во-первых, здесь присутствуют амино­кислоты в D-форме и аминокислоты с двумя аминогруп­пами. Обе аминогруппы этих аминокислот могут обра­зовывать не только пептидные связи между собой, но и дополнительные пептидные связи между гетерополимерными цепями пептидогликана. В образовании пеп­тидных связей обычно участвуют карбоксильная груп­па D-аланина одного тетрапептида и свободная амино­группа другого. Иногда эти связи образуют другие аминокислоты. В образовании пептидных связей уча­ствуют не все пептидные мостики, часть их находится в свободном состоянии или образует ковалентные связи с другими химическими веществами клеточной стенки. Частота таких «сшивок» может быть различной.

Наряду с пептидогликаном в клеточной стенке грамположительных бактерий содержатся полимерные соединения — тейхоевые кислоты, в молекулы кото­рых входит спирт рибит или глицерин. Свободные гидроксилы в молекулах спиртов могут замещаться остатками различных аминокислот, глюкозы и некото­рых других Сахаров. Кроме того, в клеточной стенке этих бактерий в небольших количествах представлены полисахариды, белки и липиды. Все три класса соеди­нений, образующих клеточную стенку, связаны между собой ковалентными связями и представляют собой очень прочную упорядоченную структуру.

Клеточная стенка у грамотрицательных бакте­рий устроена еще более сложно (рис. 5.5.). Она состоит из нескольких слоев: внутренний тонкий слой образо­ван пептидогликаном, наружный слой представляет собой мембрану, состоящую из белков, липидов и по­лисахаридов. Между ними, в периплазматическом пространстве, расположен рыхлый слой белков.

Некоторые бактерии имеют отличия в строении клеточной стенки (метанообразующие, галофильные), другие не имеют ее вовсе (микоплазмы).

Клеточная стенка выполняет ряд физиологических функций:

1) механическую;

2) защитную;

3) транспортную;

4) служит местом локализации ряда веществ, напри­мер ферментов у грамотрицательных бактерий в периплазматическом пространстве между двумя мембранами и др.

Защитной функцией обладают и слизистые обра­зования поверхностных структур, состоящие главным образом из особых полисахаридов и реже из полипеп­тидов. Они же могут служить местом запаса воды и питательных веществ и одним из способов взаимной связи между соседними клетками у колониальных микроорганизмов.

Многие прокариоты способны к активному движе­нию. Направленные движения микроорганизмов назы­вают таксисами. В зависимости от действующего фак­тора различают хемо-, аэро-, фототаксисы и др. У разных микробов наблюдаются различные формы дви­жения:

1. Жгутиковое. Жгутики представляют собой много­кратно изогнутые длинные структуры, которые прикреп­лены к ЦПМ. В состав жгутиков входит специфический белок флагеллин. Энергия для движения с помощью жгутиков получается при превращении градиента элек­трохимического потенциала в механическую работу.

2.Извивание. Например, у спирохет вокруг прото­пласта обвивается аксиальная (опорная) нить, состоя­щая из тех же веществ, что и жгутики. Движение спи­рохет происходит за счет вращения аксиальных фиб­рилл в периплазматическом пространстве между пептидогликановым слоем и наружной мембраной. Это вращение создает на поверхности клеточной стенки эластичную волну, благодаря которой спирохеты могут быстро вращаться вокруг своей длинной оси, извивать­ся и передвигаться в жидкой среде по винтовому или волнообразному способу.

3. Скольжение. Некоторые бактерии, не обладающие жгутиками, передвигаются по твердому субстрату за счет скольжения (миксобактерии, нитчатые серобакте­рии и др.). Это слизеобразующие микроорганизмы. Объяснение механизма движения этих бактерий ви­дят в гипотезе бегущей волны.

Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) у многих бактерий является единственной мембраной. На ее долю приходится 8 — 15 % сухой массы клетки. У фототрофных микроорганизмов, использующих энергию солнечного света, и хемоавтотрофных, пользующихся энергией окисления химических веществ, формируют­ся мембранные структуры, тесно связанные с ЦПМ и выполняющие функции фотосинтеза и хемосинтеза. Они получили название внутрицитоплазматических мембран. Химический состав ЦПМ у грамположительных и грамотрицательных бактерий и эукариот прак­тически одинаков.

Цитоплазматическая мембрана бактерий выполня­ет много функций.

1) барьерную;

2) здесь находятся ферменты, с участием которых происходит образование различных компонентов клеточной стенки;

3) в ЦПМ расположены электронтранспортные цепи фотосинтеза, хемосинтеза, дыхания, анаэробного дыхания и ферментные комплексы, обеспечивающие превращение электрохимической энергии в энергию макроэргов АТФ;

4) ЦПМ участвует в процессах передачи наследственных свойств благодаря закреплению на ней кольцевой ДНК клетки, в поглощении воды и элементов питания.

Типичных органелл, т.е. структур, обособленных от цитоплазмы, у прокариот нет. Среди внутрицитоплаз­матических мембран бактерий следует отметить мезосомы, выполняющие функции энергообмена, а также выделения (секреторные функции). Предположительно с мезосомами связывают компартментацию клеток, обес­печивающую определенную последовательность в ходе различных ферментативных реакций, доставку субстра­тов для синтеза клеточной стенки. К внутрицитоплазматическим структурам относятся тилакоиды пурпурных бактерий, хлоросомы зеленых бактерий и фикобилисомы цианобактерий, выполняющие фотосинтетическую фун­кцию. Хлоросомы в виде продолговатых пузырьков дли­ной 90—150 нм и шириной 25 — 75 нм окружены одно­слойной мембраной толщиной 2 — 3 нм, состоящей толь­ко из молекул белков. Хлоросомы плотно примыкают к ЦПМ. В них содержатся бактериохлорофиллы, роль которых заключается в улавливании квантов света. Фикобилисомы имеют вид гранул диаметром 25 — 55 нм. В них располагаются пигменты белковой природы — фикобилипротеиды, растворимые в воде. Они также способны улавливать энергию солнечного света.

Цитоплазма, состоящая из белков, продуктов обме­на веществ и различных субстратов, носит название цитозоля. Другая часть, структурная, содержит гене­тический аппарат, рибосомы, а у некоторых микроор­ганизмов и внутрицитоплазматические мембраны, и различные включения. Вся цитоплазма насыщена ри­босомами, где осуществляются, как и у высших расте­ний, синтез белка. Рибосомы отличаются от рибосом эукариот своими меньшими размерами. Число рибо­сом в бактериальных клетках зависит от интенсивно­сти биосинтеза белка в них.

Генетический аппарат прокариотной клетки пред­ставлен, как правило, одной молекулой ДНК, имеющей форму кольца и названной бактериальной хромосомой. Впечатляют ее размеры: в развернутом виде ее длина почти в 1000 раз превышает длину прокариотной клет­ки. Бактериальная хромосома — высокоупорядоченная, компактная и суперспирализованная структура, име­ющая у большинства бактерий молекулярную массу в пределах 1—3 10⁹. Наибольшая масса генетического материала у цианобактерий — 8,5.10⁹, а наименьшая — у микоплазм, равная всего лишь 0,4 —0,5.10⁹.

Молекула ДНК располагается в определенном ме­сте цитоплазмы и не отделена от нее мембраной, как у эукариот. Поэтому в отличие от последних генетичес­кий аппарат прокариот называют нуклеоидом, а не ядром. Гистоны у большинства бактерий отсутствуют. Лишь недавно гистоноподобные белки, связанные с ДНК, обнаружены у некоторых микоплазм и некоторых цианобактерий. У каждого вида содержание пар азоти­стых оснований А + ТиГ + Цв молекуле ДНК посто­янно и служит важным диагностическим признаком.

Удвоение молекул ДНК предшествует делению прокариотной клетки и начинается в точке прикрепле­ния кольцевой хромосомы к ЦПМ. Здесь расположе­ны ферменты, которые участвуют в процессах репли­кации ДНК. Водородные связи между полинуклеотид-ными нитями разрываются, и на однонитиевых участках, как на матрице, синтезируются комплементарные цепи дочерних молекул ДНК. Параллельно с репликацией ДНК происходит рост мембраны на уча­стке контакта ДНК с ЦПМ, приводя к разделению вновь образовавшихся молекул ДНК и оформлению их в са­мостоятельные хромосомы двух дочерних бактериаль­ных клеток.

Рост бактериальной клетки представляет собой комплекс процессов биосинтеза различных веществ и формирования структурных элементов. В результате роста бактериальная клетка увеличивается в размерах до определенного момента, затем рост ее приостанав­ливается. После репликации ДНК клетка готова к раз­множению путем деления или почкования. Большин­ство грамотрицательных бактерий делится путем пе­ретяжки, а грамположительных — за счет образования поперечной перегородки.

У некоторых фото- и хемосинтетиков недавно най­дены карбоксисомы, имеющие форму многогранника с 4 — 6 сторонами; они окружены однослойной мембра­ной, состоящей из белков. В состав карбоксисом вхо­дят частицы фермента РДФ-карбоксилазы, катализиру­ющей присоединение СО₂к рибулозодифосфату.

У некоторых бактерий, обитающих в воде и в по­чве, имеются аэросомы (газовые вакуоли), которые обес­печивают плавучесть клеток: сжатие аэросом приво­дит к погружению, разбухание — к подъему.

Из запасных включений бактериальных клеток необходимо назвать полисахариды (гликоген, гранулезу и др.), полипептиды, поли- β- оксимасляную кисло­ту, полифосфаты (источники запасного фосфора), от­ложения элементарной серы у серобактерий. Эти вклю­чения могут обособляться от цитоплазмы белковой мембраной, что предохраняет их от преждевременно­го гидролиза.

Цианобактерии устроены еще более сложно. В це­лом они близки к грамотрицательным бактериям. На­ружная мембрана стенки цианобактерии покрыта сли­зистой капсулой или слизистым чехлом у нитчатых форм. Соседние клетки нитчатых цианобактерии свя­заны между собой особыми ультраструктурами, назван­ными микроплазмодесмами, которые обеспечивают непрерывность мембран и цитоплазмы соседних кле­ток. Цитоплазма с нуклеотидом обильно заполнена рибосомами. Фотосинтетический аппарат содержит хлорофилл а (хлорофилл b отсутствует) и каротиноиды, а также фикобилипротеиды — красные и синие пигменты. Цианобактерии осуществляют фотосинтез с выделением кислорода, а в темноте ведут себя как гетеротрофы. Многие из цианобактерии способны к азотфиксации.

Некоторые бактерии в определенных условиях формируют структуры, отличные от обычных вегетатив­ных клеток. В своем большинстве эти видоизмененные клетки способствуют выживаемости отдельных видов в неблагоприятных условиях среды (эндоспоры, цисты), размножению (споры актиномицетов, гормогонии циа­нобактерии) или осуществлению фиксации атмосфер­ного азота (гетероцисты цианобактерии, бактероиды клубеньковых бактерий). Эндоспоры образуются по од­ной внутри цитоплазмы некоторых грамположительных бактерий. Они обладают многослойными очень плотны­ми покровами. Эндоспоры переносят длительное кипя­чение без потери жизнеспособности, высушивание и т. д. Часть грамотрицательных бактерий способна превра­щаться в цисты — клетки с толстыми наружными по­кровами и капсулами, например у азотобактера. В форме цист азотобактер переносит длительное воздействие неблагоприятных внешних факторов.