Вибриоз крупного рогатого скота и овец

Возбудитель - Campy1abacter fetus (Vibria fetus) - подвижный грамотрица­тельный микраб, фильтруется через нитроцеллюлозные мембраны №2. В мазках из патологического материала имеет вид запятой, летящей чайки или S-образную фарму.

Различают два подвида возбудителя: С. fetus subsp. fetus (V. fetus vеnегеа­lis) и С. fetus intestinalis (V. fetus intеstinаlis). Они патогенны соответственно для крупного рагатага скота и овец; дифференцируются по некоторым биохими­ческим признакам и серологически, хотя и не всегда четко.

Материал для исследования: а) абортированный плод с оболочками; от крупных плодов- голова, желудок, печень, селезенка, легкое, часть плаценты; б) слизь из шейки матки или цервиновагинальной абласти; препуциальная слизь, сперма, секрет придатачных половых желез; в) отубитых с диагнастической целью животных - матка, яичники, влагалище и лимфаузлы тазовой области. Плоды и органы доставляют в свежем (охлажденнам или замороженном) виде в первые сутки послеаборта, а пробы слизи и сперму - не позднее чем через 6 ч с момента взятия и при условии доставки в термосе сольдом.

Исследование проводят микромкопическими, 6актериолоческими и сероло­гическими методами с установлением подвида возбудителя.

Микроскопия. Мазки в четырех сериях делают после проведения высевов из всех материалов пробы. Одну серию мазков фиксируют над пламенем и окрашивают фуксином Циля в разведении 1: 5 1-2 мин для световой микроскопии. Остальные серии фиксируют этиловым спиртом и окрашивают флуоресцирующими сыворотками: к вибрио фетус I типа, к вибрио фетус II типа и к вибрио бубулюс - для люминесцентной микроскопии.

Посевы делают в полужидкий 0,15-0,2%-ный МППА (ПЖА), в МППБ и на 2-3%-ный МППА, или на агар Мартена и в полужидкий агар Мартена или в среду СЖН. Для обагощения в среды добавляют 5-10% стерильно взятой дифибринираванной крови быка (овцы, кролика) или 5-10% амидопептида-2 или дрожжевой экстракт 0,5% или тиагликолат натрия 0,05%.

Высевы из содержимого сычуга абортираванных плодов, легкого, печени, головного мозга, амниотической жидкости и измененных участков плаценты де­лают непосредственно из каждого органа в пять пробирок с ПЖА или СЖН, и также на плотные среды.

Сперму, секрет придаточных половыхжелез от быков, слизь из шейки матки перед посевом очищают отпрубой примеси и микрабнага загрязнения путем центрифугиравания в закрытых пробирках при 1000 об/мин в течение 10 мин или фильтрования через нитрацеллюлазные мембраны №2 и № 5.

Мембранные Фильтры готовят двумя спасобами.

Первый способ. Мембраны стерилизуют кипячением в дистиллираваннай водедважды по 10 мин со сменой вады. КалбуБунзена, соединенную с прибором Зейтца, стерилизуют в автоклаве заранее. Мембраны закладывают в прибор в стерильных уславиях в таком порядке: №5, №2, № 5 (мембраны № 5 можно заменить дисками стерильной фильтровальной бумаги).

Второй способ. КалбуБунзена, соединенную с приборам Зейтца, стерилизу­ют, закладывают в прибор нестерильные мембраны, свинчивают прибор, в пере­вернутом виде погружают до пробки в дистиллированную воду и кипятят в ней дважды по 10 мин сосменой воды. Готовый фильтр используют тотчас послеохлаждения.

Посев на плотные среды: 0,3-0,5 мл центрифугата (берут непо­средственно из центрифужной пробирки) или фильтрата асептически вносят в чашку сосредой и шпателем или петлей делают истощающий дробный высев в 3-4 чашки (сектора).

Посев в палужидкие среды делают «с подсосом»в пять проби­рок: 0,5-1 мл материала пипеткой вносят у стенки на дно пробирки со средой, оставляя небольшую часть материала в пипетке; ее капилляр отводят к противоположной стенке пробирки и засасывают немного стерильной средьr; пипетку извлекают и засевают в таком же порядке последовательно еще четыре пробирки.

Пробирки помещают в эксикатор, создают в нем атмасферу с 10-15% угле­кислаты и инкубируют при 37⁰С до10 дней с просмотром посева в через каждые 3 дня.

При пасеве с подсосом, начиная с третьего дня, пробирки, в каторых рост отсутствует, просматривают ежедневно и помере выявления роста проводят микроскопию.

Культура возбудителя растет подповерхностью ПЖА в виде сероватого диска, а на МППА образует мелкорасинтчатый налет или голубоватые колонии, заметные в лупу.

При наличии типичного роста делают отвивки, а мазки из культур окраши­вают для светавой и люминесцентной микроскопии, как описано выше. При обнаружении положительного свечения вибрионов, окрашенных сыворотками к V. fetus, культуру исследуют для дифференциации подвида возбудителя vеnеrа1is или intеstinа1is.

С целью очистки первичных культур, часто загрязненных посторонними мик­робами, применяют: а) посев культуры в пастеровские пипетки под слой палу­жидкой среды. Для этого готовят отдельные пробирки с ватно-марлевыми проб­ками, в которые вставлены пипетки. Сначалa пипеткой забирают немного ПЖА или СЖИ, а затем культуру с полужидкой среды. Пипетку помещают в про­бирку и инкубируют; б) дробный посев культуры на плотную среду и последующий отсев типичных колоний возбудителя в ПЖА; в) пересев культуры «с под­сосом» в пять пробирок с ПЖА, как описано выше.

Для биохимической дифференциации плодовых вибрионов при­меняют высевы чистых культур в среды: ПЖА (проба на каталазу), МПБ и ПЖА с 0,02% цистина (проба на сероводород); в 0,15%-ный и уколом в 0,5%-ный ПЖА (проба на характер роста); в ПЖА с 4% желчи, в ПЖА с 1 % глицина и в ПЖА с 3,5% хлорида натрия.

Проба на каталазу. Чистую культуру вибриона выращивают в пробирке с 2-3 мл ПЖА трое суток. Рост микроба должен быть пышный. Ватную пробку заменяют резиновой и приливают к культуре осторожно, по стенке, 3%-ный водный раствор перекиси водорода (или 10%-ный раствор пергидроля) в равном объеме. Пробирку плотно закрывают и 2-3 раза осторожно, следя за тем, что­бы не образовывалась пена, переворачивают вверх дном. Пена слоем более 5 мм может образовываться сразу же или в процессе выдерживания в термостате в течение 15-20 мин - проба на каталазу положительна. Если за этот срок пена не образуется или ее слой менее 5 мм - проба отрицательная.

Серологическая идентификация культур вибрионов выполняется с помощью моноспецифических агглютинирующих сывороток к обоим подвидам возбудителя и сапрофитному вибриону (V. bubulus) - частому спутнику первых двух подви­дов возбудителя.

Штаммы, подлежащие проверке, культивируют в 2-3 генерациях с пересе­вом через каждые три дня на ПЖА или полужидком агаре Мартена. Выращива­ние ведут, как и при первичных посевах. 2-3-суточные культуры с типичным ростом под поверхностью среды пересевают на аналогичную плотную среду с 2-3% агар-агара по 0,3-0,5 мл на одну чашку и инкубируют в течение 2­3 дней.

При отсутствии роста посторонних микробов культуру смывают физиологи­ческим раствором с 0,3% формалина, ценгрифугируютпри 3000 об/мин 12-15 мин и дважды промывают таким же раствором при тех же условиях. Осадок промытых вибрионов суспендируют в физиологическом растворе, доводят до концентрации 10 единиц мутности и используют как антиген.

Постановка пробирочной реакции агглютинации. Каждый полученный анти­ген проверяют тремя моноспецифическими и двумя нормальными кроличьими сыворотками (контроль). Все сыворотки разводят в нужном объеме 1:25, 1:50. 1:100 и 1: 200 3%-ным paствором хлорида натрия с 0,3% формалина и раз­ливают по 0,5 мл в ряды пробирок по числу антигенов. Каждый антиген вносят 0,5 мл во все пробирки своих пяти рядов, таким образом конечные разведения сывороток в реакции удваиваются.

Дополнительные контроли реакции: а) нормальная кроличья сыворотка в тех же разведениях таким же раствором плюс фабричный антиген; б) каждый проверяемый, а также фабричный антигены плюс 3%-ный раствор хлорида натрия с 0,3% формалина.

После разлива антигенов пробирки тщательно встряхивают и выдерживают при 37⁰С до следующего утра, а затем при комнатной температуре 4 часа и учитывают результат.

Оценка реакции: положительная - полное просветление жидкости, рыхлый осадок, разбивающийся при осторожном встряхивании на мелкие хлопья; сомнительная - неполное просветление жидкости, осадка меньше; отри­цательная - жидкость мутная, осадка нет или он незначителен и при встряхива­нии переходит в равномерную муть.

Постановка капельной реакции агглютинации. Чистое обезжиренное стекло размером 12Х4 см расчерчивают восковым карандашом поперечными линиями на четыре равные части и маркируют. В три клетки вносят по капле моноспе­цифических сывороток І, ІІ и ІІІ типов в разведении 1: 50, а в четвертую-каплю физиологического раствора. В каждую каплю вносят по полной петле испытуемой двухсуточной культуры, выращенной в ПЖА, перемешивают, слегка подогревают и просматривают на темном фоне.

При положительной реакции появляются мелкие комочки и хлопья агглюти­натов, а при отрицательной взвесь равномерно мутная. Данные реакции оцени­вают ориентировочно.