Колибактериоз

Возбудители колибактериоза молодняка сельскохозяйственных и промысловых животных - патогенные типы Eschtrihia coli (кишечнай палачки). Наиболее часто выделяются серотипы следующих О-групп: у телят - 08, 09, 078, 015, 0101, 0119, 086, 020, 035, 0103, 0142, 0147, 026, 0127 и др.: у порасят - 08, 0138, 0139. 0141, 0142 0147, 026 и др.; у овец- 08, 09, 020, 035, 078, 0101, 0137, 015, 041 и др.; у птиц - 0, 2, 041, 078, 018, 01, 8, 0115, 026, 055, 0111, 015 и др.

Болезнь протекает в септической, энтеротоксемической и энтеритной формах.

При последних двух формах возбудитель локализуется в желудочно-кишечном тракте и в регионарных брыжеечных лимфоузлах.

Eschtrihia coli - слабоподвижная или неподвижная палочка; хорошо растет в аэробных и анаэрабных уславиях; грамотрицательна. На среде Эндо колонии круглые, сочные,Красные с малиновым или розовым оттенком; на среде Левина фиолетовые черные.

Материал для иссл едо вания: от павших - сердце с перевязанными сосудами, трубчатая кость, кусочки селезенки, доля печени с желчным пузырем, измененные лимфоузлы брыжейки - все в свежем виде или в 30 % растворе глицерина можно в 10% -ном растворе хлорида натрия; отрезок тонкого отдела кишечника, перевязанный двумя лигатурами; мелкие свежие трупы целиком, а птиц, кроме­ того, 5-6 больных с явными клиническими признаками.

Исследование состоит из выделения культуры возбудителя, ее серологического типирования и проверки патогенности.

Посевы из крови сердца, всех органов и измененных лимфоузлов брыжейки в МПБ или на косой агар делают пипеткой, а в чашки со средами Эндо и Леви­на материал рассевают шпателем или наносят отпечатки поверхностью свежего­ среза. Из целых трупов и от больных птиц, убитых перед вскрытием, посевы де­лают так же и, кроме того, из головного мозга.

Из фекалий делают взвесь 1:100 в физиологическом растворе и после от ­ стаивания 10-15 мин высевают одну каплю дробно на агар Левина и Эндо в чашки.

Посевы инкубируют при 37⁰С до появления роста, но не более 2 суток. Из колоний, выросших в высевах не менее чем из двух органов, отбирают по две типичные колонии S-формыи из каждой делают отсевна касой МПА в две пробирки. Полученные культуры используют: одну для пригатовлений мазков, культурально-биохимического исследования и заражения белых мышеи; другую для пригатовления убитых кипячением и автоклавированием антигенов и сероло­гического типирования.

В посевах из каждой пробы фекалий отсевают и серологически типируют не менее 10 коланий, а культурально-биохимические свойства и патогенность изуча­ют у четырех типированных культур. Если же культуры не типируются имею­щимися колисыворатками, то культурально-биохимически исследуют четыре не­типированные культуры с обязательной проверкой патогенности каждой от­дельно.

Культурально-биохимическое исследование. Смывы суточных агаровых культур, полученных из атобранных колоний, доводят до концентрации 1 млрд/мл по стандарту мутности. Часть каждого смыва отделяют для биало­гического исследования, а другую высевают в среды Андредэ с лактозой, глю­козой, маннитом, сахаразой, дульцитом, аданитом и иназитом; в среду Кларка, бульон с мочевиной, среды Козера и Симмонса (см. Вазбудитель колибактериа­за) в МПЖ на агар с глюказой и сернокислым железом (посев делают штрихом по агару, а затем уколом в столбик или в МПА с праверкой на образование индола и сероводорада и в 0,3%-ный полужидкии МПА - на подвижность.

Постановка реакции с метилротом на интенсивность кислото-образования. Поасев в среду Кларка инкубируют 2 суток. 1 мл культуральной жидкости переносят в чистую пробирку для реакции Фагеса-Праскауэра. К остатку добавляют 5 капель раствора метилрота (см. Возбудитель колибактериоза), встряхивают и отмечают результат: порозовение среды указывает, что ее рН ниже 5,0 - реакция положительная; желтый цвет, рН выше 5,0 - реакция отри­цательная а желто-оранжевый - сомнительная.

Проба на ацетилметилкарбинол (реакция Фогеса - Проскауэра). К 1 мл культуральной жидкости добавляют 0,2 мл 40%-ного вадного раствора едкого калия и 0,5 мл 6%-ного спиртового раствора альфа-нафтола и встряхивают.

Оценка реакции: среда розавая, ацетилметилкарбинол есть – реакция поло­жительная; среда желтая - отрицательная, среда желта-оранжевая - сомни­тельная.

Биологическое исследование. Оставшуюся часть смывов в концентрации 1 млрд/мл используют для заражения белых мышей массой 14-16 г. Взвеси типираванных культур (не менее 4), выделенных из однай пробы патологического материала или фекалий, смешивают в равных объемах и вводят внутрибрюшинно трем мышам по 0,5 мл.

Нетипираванные культуры (4), выделенные из фекалии, проверяют на патогеннасть каждую отдельно вышеописанным порядком.

Патогенные свойства эшерихий, выделенных отптиц, можно проверять биопробой на 4-5-недельных цыплятах. Взвеси культур вводят трем цыплятам внутрибрюшинно по 0,5 мл.

Культуру признают патогенной в случае гибели хотябы одной мыши (цып­ленка) в первые 4 суток после заражения при условии выделения из трупа исходной культуры.

Серологические исследования. После контрольной микроскопии мазков, окра­шенных по Граму, оставшиеся культуры смывают с каждого косяка 4-5 мл фи­зиологического раствора, переносят в чистые пробирки, доводят физиологическим раствором до концентрации 3-4 млрд/мл, розделяют каждую взвесь пополам и маркируют графитным карандашом на полосках пергаментной бумаги, котарые фиксируют ватными пробками.

Приготовление антигенов кипячением. Половину взвесей в пробирках кипятят на водяной бане 1 ч, следя, чтобы вода в бане была выше уровней взвесей в пробирках. При образовании хлопьев (R-форма бактерий) взвеси бракуют. Затем взвеси охлаждают и центрифугируют при 3000-4000 аб/мин 15 мин. Центрифу­гаты сливают, а каждый осадок (брать петлей) испальзуют в пластинчатой и пробирочной РА.

Приготовление антигенов автоклавированием проводят обычно адновременно. Оставшуюся полавину взвесей автоклавируют при 1 ати 2 ч. Для разрушения термостабильного А-антигена и центрифугируют при том же режиме.

Постановка пластинчатой реакции агглютинации. Комп­лексные O-коли-сыворатки перед употреблением разводят 1:5 физиолагическим растворам. Если таких нет, их готовят на месте. В стерильные пробирки нали­вают по 1 мл 5-6 монорецепторных О-сыворатак, саответствующих серотипам Е. coli, наибалее часто встречающимся у данного вида живатных местной зоны; добавляют физиалогический раствор до 10 мл, перемешивают и получают комп­лексную сыворотку в рабочем разведении 1:10. Так же готовят смеси из других монорецепторных О-сывороток. Они сохраняют активность при 4⁰С в течение четырех месяцев.

На чистое предметнае стекло нанасят поодной капле каждой комплексной сыворотки. Испытуемый кипяченый антиген вносят петлей поочередно во все капли и перемешивают стеклянной палочкай или петлей. Реакцию читают в те­чение 3 мин, покачивая стекло. Кантрольную реакцию ставят в капле физиологи­ческого раствора.

Антиген, дающий реакцию со всеми комплексными О-сыворат­ками или самоагглютинацию в кантроле, признают непригодным.

Антигены, реагирующие с однай из комплексных О-сыворотак, проверяют в капельной РА с типовыми сыворатками (разведенными 1:1О), входящими в состав комплексной, и при паложительной реакции с 1-3 сыворотками серотип антигена уточняют в прабирочной РА с реагировавшими сыворотками.

Постановка пробирочной реакции агглютинации. Реаги­рававшие в пластинчатой РА типовые сываротки разводят физиологическим раствором, начиная с 1: 100, и далее двукратно дотитра сыворотки. Реакцию ставят в объеме 1 мл. Оставшийся от пластинчатой РА осадок антигена разводят физиалогическим растворам до концентрации 5-6 млрд/мл по аптическаму стан­дарту и вносят по две капли во все пробирки с разведениями сывараток.

Кантроли: антиген + физиолагический раствар; сыворотки в разведении 1:100, без антигена.

Штатив с пробирками встряхивают и выдерживают при 37-38⁰С 12-16 ч, а затем при камнатнай температуре 18-24 ч. Реакцию читают при помощи лупы или агглютиноскопа.

Антиген считают гомологичным той сываротке, с которой он реагировал в наиболее высоких ее, разведениях и не ниже половины ее титра.

В случаях, когда, все комплексные О-коли-сыворотки дали с кипяченым ан­тигеном отрицательную реакцию, проверяют автоклавированный антиген той же культуры. Этот антиген исследуют с коли-сыворотками 08, 09 и 0101 в плас­тинчатой и пробирочной реакции агглютинации, что выполняют, как указано выше.

Если кипяченый и автоклавированный антигены не агглютинируются ни од­най из имеющихся в наборе О-кали-сывороток, данную культуру считают непа­тогенной при условии, что биопроба также отрицательна.