Методические аспекты

Реактив Самсона: фуксин (спиртовой раствор 1:10) - 2,5 мл; уксусная кислота ледяная - 30 мл; карболовая кислота концентрированная - 2,0 мл; дистиллированная вода - до 100 мл.

Входящие в состав реактива Самсона компоненты обеспечивают надежный подсчет общего количества клеток (цитоз или плеоцитоз) и ликворной формулы. Так, 30% уксусная кислота лизирует эритроциты, фуксин окрашивает ядра клеточных элементов и включения в цитоплазме в интенсивный темно-вишневый, цитоплазму плазматических клеток - в ярко-малиновый цвет, а карболовая кислота консервирует клетки до 2-3 часов при комнатной температуре и до суток - при хранении в холодильнике.

Ход определения: ликвор тщательно, без пены размешивают, катая пробирку между ладонями, затем выливают небольшое количество на часовое стекло. В смеситель для подсчета лейкоцитов набирают до метки "1" реактив Самсона, а до метки "II" - ликвор. Содержимое смесителя несколько раз встряхивают и оставляют для окрашивания клеточных элементов на 10-15 мин. Ликвор можно окрасить в пробирке, на часовом стекле и в ячейке штатива для гемагглютинации: 0,5 мл ликвора и 50 мкл реактива Самсона или 10 капель ликвора и 1 капля реактива Самсона, используя одну и ту же пластиковую пастеровскую пипетку.

Подсчет в камере Фукса-Розенталя. Для счета клеток в спинно-мозговой жидкости применяется камера Фукса-Розенталя, объем которой 3 мкл. Камера Фукса-Розенталя состоит их больших квадратов, каждый из которых разделен на 16 малых, всего в камере содержится 256 малых квадратов. Малый квадрат является счетной единицей камеры.

Перед заполнением камеры окрашенный ликвор тщательно размешивают в меланжере путем осторожного встряхивания или катания между ладонями; пипеткой - в пробирке, на часовом стекле или в ячейке штатива для определения гемагглютинации. Из меланжера первые 2-3 капли удаляют, а 3-й или 4-й каплей заполняют камеру. Клетки, если их мало, подсчитывают во всей сетке камеры, используя объективы х8, х10 или х20 и окуляр х7 или х10 на бинокулярном микроскопе. Некоторые врачи и лаборанты считают ликворные клетки с окуляром х15. Количество клеток в 1 мкл ликвора (X) определяют по формуле: Х = (A x 11) / (3,2 x 10), где А - количество клеток в камере, 11/10 - степень разведения ликвора, 3,2 - объем камеры.

На практике объем камеры округляют до 3 мкл и не учитывают степень разведения ликвора: Х = A / 3

Ответ представляют в виде дроби 12/3 (12 клеток в 3 мкл), или в мкл - 4/мкл (4 клетки в 1 мкл), или в 1 литре ликвора (СИ) - 4x10⁶/л.

Согласно рекомендациям ликворологической лаборатории НИИ нейрохирургии им. Бурденко, при подсчете клеток в камере Фукса-Розенталя поступают следующим образом:

• если клеток настолько много, что сетка не видна, дается описательный ответ: клеточные элементы густо покрывают камеру и количественному подсчету не подлежат;
• если клеток в заполненной ликвором камере очень много (но сетка видна), их подсчитывают в одном малом квадрате камеры, а полученный результат умножают на 256;
• если клеток несколько меньше (сетка видна), клетки считают в одном ряду малых квадратов (16 малых квадратов) и полученный результат умножают на 16;
• если клеток еще меньше, клетки считают в 2 рядах малых квадратов (32 малых квадрата), а результат умножают на 8;
• если клеток мало, клетки подсчитывают во всей камере, в 256 малых квадратах.

Е.М. Цветанова (1986) при большом плеоцитозе в ликворе рекомендует считать клетки в больших квадратах камеры Фукса-Розенталя:

• если до 1000 клеток - в 8 больших квадратах, результат умножить на 2;
• если до 3000 клеток - в 4 больших квадратах, результат умножить на 4;
• если до 4000 клеток - в 2 больших квадратах, результат умножить на 8;
• если до 5000 клеток - в 1 большом квадрате, результат умножить на 16;
• если количество клеток очень большое, клетки считать в 1 малом квадрате, результат умножить на 256.

Если клеточный ликвор предварительно разводят физиологическим раствором, то полученное число клеток умножают на степень разведения. Ответ представляют:

• в виде дроби - 12/3 (2253/3);
• в 1 мкл - 4/мкл (731/мкл);
• в 1 л (СИ) - 4x10⁶/л (731 x 10⁶/л или 0,731 x 10⁹/л)

После подсчета в камере Фукса-Розенталя общего количества клеток (цитоз или плеоцитоз) можно провести дифференциацию клеток, используя окуляр х7 или х10 и объектив х40 на бинокулярном микроскопе.

К сожалению, не все камеры Фукса-Розенталя можно исследовать на большом увеличении микроскопа из-за их толщины. Рекомендуем каплю хорошо размешанного ликвора, окрашенного реактивом Самсона, нанести на обычное предметное стекло и покрыть покровным стеклом и дифференцировать ликворные клетки на большом увеличении микроскопа. Если некоторые клетки окажутся непонятными, на покровное стекло можно нанести каплю иммерсионного масла и исследовать клетки на иммерсии (при увеличении х900 или х1000).

Если в ликворе клеток мало (нормоцитоз или слабовыраженный плеоцитоз), ликвор нужно подвергнуть центрифугированию в течение 10 мин со скоростью 1500 об/мин, слить или отсосать пластиковой пастеровской пипеткой надосадочный ликвор, той же пипеткой аккуратно размешать осадок. С помощью пластикового шпателя (или покровного стекла) сделать 2-3 мазка для окраски азур-эозином, а в осадок внести 1 каплю реактива Самсона и аккуратно смешать.Через 10 мин каплю окрашенного реактивом Самсона осадка ликвора нанести на предметное стекло и покрыть большим покровным стеклом. Количество клеток в осадке стало больше и возможна их дифференцировка на большом увеличении (х400) и на иммерсии (х900 или х1000). Провести дифференцировку 100 и/или 200 клеток и дать ответ в % в виде ликворной формулы. Тканевые клетки можно ввести в формулу и также представить в % или дать их количество на 100 лейкоцитов.

Определение истинного количества клеточных элементов
в ликворе с примесью "путевой" крови. Метод Фридмана

Для определения общего количества клеток ликвор окрашивают реактивом Самсона и считают клетки в камере Фукса-Розенталя.

Для определения количества "путевых" эритроцитов ликвор разводят физиологическим раствором в пробирке или в лейкоцитарном меланжере в 10 раз: 2 мл физ. р-ра + 20 мкл хорошо размешанного кровянистого ликвора или до метки "1" в лейкоцитарный меланжер набирают кровянистый ликвор, до метки "II" - физиологический раствор.

Разведенный ликвор хорошо перемешивают и заполняют камеру Горяева. Эритроциты считают в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых и расположенных в камере по диагонали. Расчет проводят по формуле: Х = (A x 4000 x 10) / 80 = A x 500, где А - количество эритроцитов в 5 больших квадратах, 4000 - 1/4000 - объем одного малого квадрата камеры, 10 - степень разведения ликвора, 80 - количество малых квадратов в 5 больших.

Если "путевых" или ликворных эритроцитов мало, ликвор разводить не следует. Камера Горяева заполняется каплей тщательно размешанного ликвора, эритроциты считают в 5 больших квадратах и расчет производят по формуле: Х = (A x 4000) / 80 = A x 50

Затем сравнивают соотношение количества лейкоцитов к количеству эритроцитов в периферической крови, взятой у больного накануне пункции, с результатами, полученными в исследуемом ликворе.

Например: в 1 мкл ликвора с примесью "путевой" крови 12 000 эритроцитов, а плеоцитоз-32; в 1 мкл периферической крови больного 4 000 000 эритроцитов и 8000 лейкоцитов, следовательно, на один лейкоцит в периферической крови приходится: 4 000 000 / 8000 = 500 эритроцитов

Так как в ликворе все 12 000 эритроцитов попали из периферической крови, в которой на 1 лейкоцит приходится 500 эритроцитов, можно сосчитать, сколько лейкоцитов (X) попало с "путевой" кровью в ликвор по пропорции: X = (12 000 x 1) / 500 = 24 лейкоцита попали в ликвор с 500 к эритроцитами (с путевой кровью).

Истинное (корригированное) количество лейкоцитов в ликворе: 32 - 24 = 8 лейкоцитов в 1 мкл ликвора.

Примечание. Этот метод применим только при небольшой примеси "путевой" крови.

Приготовление и окраска препаратов ликвора
для цитологического исследования

Препараты для окраски азур-эозином можно приготовить из осадка после обычного центрифугирования ликвора, на цитоцентрифуге, цитоспине или с помощью седиментации на аппарате Сайка.

Для получения однослойных препаратов ликвора на цитоцентрифуге рекомендуется:

• для стабилизации клеток к 0,5 мл ликвора сразу после пункции добавить 2 капли 22% раствора альбумина;
• препараты, полученные на цитоцентрифуге, затем высушить на воздухе, зафиксировать и окрасить.

После центрифугирования на цитоцентрифуге 0,5 мл ликвора с цитозом 3-5 клеток в 1 мкл получается препарат, содержащий не менее 1500-2500 клеток.

Высохшие на воздухе мазки, сделанные из осадка ликвора, необходимо зафиксировать в метиловом спирте или с помощью фиксатора-красителя Мая-Грюнвальда и окрасить азур-эозином по Романовскому или Нохту. Рабочий раствор краски готовится ех tempore на буферной воде с рН 6,8-7,2 (смесь Вейзе), время использования рабочего раствора краски ограничено (60-90 мин), длительность окраски препаратов индивидуальная и отрабатывается предварительно для каждой серии препаратов.

Эти мазки можно зафиксировать и окрасить с помощью комбинированного фиксатора-красителя "Гемокрафикс" (фирма "Эко-Лаб"). Время фиксации и окраски одного мазка фиксатором-красителем "Гемокрафикс" на рельсах составляет 8-10 мин.

Метод окраски. Стекло с нефиксированным мазком положить на рельсы и залить 2 мл фиксатора-красителя "Гемокрафикс" на 3 мин, затем по каплям добавить на фиксатор-краситель такое же количество буферной воды с рН 7,0 и оставить на мазке еще на 5-7 мин. Краску с препарата слить и смыть остатки краски водопроводной водой с обратной стороны стекла.

Утверждение, что препараты, приготовленные из ликвора или его осадка, должны окрашиваться только специально приготовленными соотношениями гематологических красок (окраска по Возной или Розиной), на практике не подтверждается. Для хорошей окраски мазков ликвора, так же как для мазков крови и других цитологических препаратов, используются одни и те же соотношения азура и эозина, буферная вода, хорошая предварительная фиксация и соблюдение времени окраски.

При окраске на автоматах "Гема-Тек" или ПОМК-01 мазки ликвора фиксируются, окрашиваются, промываются и сушатся в течение 10 мин, так же как гематологические и другие цитологические препараты (мазки крови, костного мозга, выпотных жидкостей, спермы и др.).

Слайд-планшеты для исследования ликвора,
окрашенного реактивом Самсона

Для цитологического исследования ликвора, окрашенного реактивом Самсона, можно использовать пластиковые слайд-планшеты (те же, что и для исследования мочи). В камере удобно и просто дифференцировать клеточные элементы ликвора на большом увеличении микроскопа (окуляр х10 и объектив х40 при работе с монокуляром; окуляры х7 или х10 и объектив х40 - с бинокуляром).

В каждой камере слайд-планшета есть место для подсчета клеточных элементов в определенном объеме жидкости. Это 18 ячеек круглой формы, составляющих по объему 0,2 мкл. В 1 мкл люмбального ликвора в норме содержится всего 3-5 клеток. Поэтому при слабом плеоцитозе при условии, что клетки в камере распределены равномерно и попали в ячейки, можно подсчитать их количество в 18 ячейках камеры слайд-планшета. Полученное в 0,2 мкл ликвора количество клеток (в 18 ячейках) пересчитать на их содержание в 1 мкл ликвора по формуле: X = (A x 10) / 2, где X - количество клеток в 1 мкл ликвора; А - количество клеток в 18 ячейках камеры слайд-планшета (в 0,2 мкл ликвора); 10 - цифра для получения количества клеток в 2 мкл; 2 - цифра для пересчета количества клеток на 1 мкл ликвора.

Например: в 18 ячейках камеры обнаружено 28 клеток, тогда X = (28 x 10) / 2 = 140/мкл или 140 x 10⁶/л

Если клеток очень много (умеренный или выраженный плеоцитоз), можно считать клетки в 9 ячейках камеры слайд-планшета и расчет производить по формуле: X = В х 10, где X - количество клеток в 1 мкл ликвора; В - количество клеток в 9 ячейках камеры слайд-планшета (в 0,1 мкл ликвора); 10 - цифра для получения количества клеток в 1 мкл ликвора.

Например: в 9 ячейках камеры подсчитано 370 клеток, следовательно X = 370 х 10 = 3700/мкл, или 3700x10⁶/л, или 3,7x10⁹/л.

Если клетки покрывают все ячейки камеры (резко выраженный или массивный плеоцитоз), можно считать клетки в 1-й ячейке и расчет производить по формуле: Х = С х 9 х 10, где X -количество клеток в 1 мкл ликвора; С - количество клеток в одной ячейке камеры слайд-планшета; 9 - цифра для пересчета количества клеток в 9 ячейках камеры слайд-планшета; 10 - цифра для получения количества клеток в 1 мкл ликвора.

Например: в 1 ячейке - 145 клеток, следовательно X = 145 х 9 х 10 = 13 050 x 10⁶/л или 13,05 x 10⁹/л.