Культуральные и биохимические свойства нейссерий и Br.catarrhalis

6 7 8 9 10 11 12

┌──────┬──────────────┬────┬────┬────────────────────────┬────┬─────────┐

│Возбу-│Отношение к │За- │Об- │ Сахаролитическая │Об- │Редук- │

│дитель│условиям │ви- │ра- │ активность │ра- │ция** │

│ │культивирова- │си- │зо- │ │зо- │ │

│ │ния │мо- │ва- │ │ва- │ │

│ │ │сть │ние │ │ние │ │

│ │ │рос-│пиг-│ │по- │ │

│ │ │та │мен-│ │ли- │ │

│ │ │от │та │ │са- │ │

│ │ │С02 │ │ │ха- │ │

│ │ │при │ │ │ри- │ │

│ │ │пep-│ │ │да │ │

│ │ │вич-│ │ │на │ │

│ │ │ном │ │ │ara-│ │

│ │ │вы- │ │ │pe │ │

│ │ │де- │ │ │с 5%│ │

│ │ │ле- │ │ │са- │ │

│ │ Рост на │нии │ │ │ха- │ │

│ │ │ │ │ │ро- │ │

│ │ │ │ │ │зы │ │

├──────┼────┬────┬────┼────┼────┼────┬─────┬───┬────┬────┼────┼────┬────┤

│ │сы- │бес-│сре-│ │ │глю-│маль-│са-│лак-│фру-│ │ни- │ни- │

│ │во- │сы- │де с│ │ │коза│тоза │ха-│тоза│кто-│ │тра-│три-│

│ │ро- │во- │0,2%│ │ │ │ │ро-│ │за │ │тов │тов │

│ │точ-│ро- │жел-│ │ │ │ │за │ │ │ │ │ │

│ │ном │точ-│чи │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │агa-│ном │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │pe │ага-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │37°С│ре │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │37°С│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

├──────┼────┼────┼────┼────┼────┼────┼─────┼───┼────┼────┼────┼────┼────┤

│N.gon-│ + │ - │ - │ + │ - │ К │ - │ - │ - │ - │ - │ - │-(+)│

│orrhe-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ae │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│N.men-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ingit-│ + │ - │ - │ + │ - │ К │ К │ - │ - │ - │ - │ - │ - │

│idis │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│N.sub-│ + │+(-)│ + │ - │ + │ К │ К │ - │ - │ - │ - │ - │ + │

│flava │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│N.per-│ + │ - │ + │ - │ + │ К │ К │ К │ - │ К │ + │ - │ + │

│flava │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│N.fla-│ + │+(-)│ + │ - │ + │ К │ К │ - │ - │ К │ - │ - │ + │

│va │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│N.sic-│ + │+(-)│+(-)│ - │+(-)│ К │ К │ К │ - │ К │ + │ - │ + │

│ca │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│N.muc-│ + │ + │ + │ - │ - │ К │ К │ К │ - │ К │ + │ + │ + │

│osa │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│N.fla-│ + │+(-)│ + │ - │ + │ - │ - │ - │ - │ - │ + │ - │ + │

│vesce-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│ns │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│N.lac-│ + │ + │ + │ - │ + │ К │ К │ - │ К │ - │ - │ + │ + │

│tamica│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Br.ca-│ + │ + │ + │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ - │ + │

│tarrh-│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│alis │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

└──────┴────┴────┴────┴────┴────┴────┴─────┴───┴────┴────┴────┴────┴────┘

Обозначения: К - образование кислоты

(-) - редко

** - тест используют как дополнительный при

дифференциации непатогенных нейссерий.

Примечание: приготовление некоторых питательных сред, приготовление реактивов для исследования редукции нитратов и нитритов, постановка этих реакций и учет см. приказ МЗ СССР N 535 от 22 апреля 1985 г. "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений."

При первом выделении клеткам менингококков свойственен полиморфизм, который проявляется в различной величине и разной интенсивности окрашивания микробных клеток. Колонии менингококков на сывороточном агаре бесцветны, круглые с ровным краем, опалесцирующие, выпуклые, имеют маслянистую консистенцию, легко снимаются петлей со среды, что отличает их от колоний непатогенных нейссерий, имеющих крошащуюся или тянущуюся консистенцию. Некоторые штаммы, выделенные из СМЖ, могут обладать слабой ферментативной активностью в отношении глюкозы или мальтозы или обоих углеводов. Большинство непатогенных видов нейссерий, в отличие от патогенных, способны при выращивании на сывороточном arape с 5% сахарозы образовывать крахмалоподобное вещество (полисахарид), выявляемое с помощью водного раствора Люголя, в виде появления бурого окрашивания культуры.

Менингококки делятся на следующие серогруппы: A, B, C, X, Y, Z, 29E, D, W135, К, H, L, У. Проведение серологического группирования менингококков является обязательным для практических лабораторий, как одна из мер эпидемиологического надзора за менингококковой инфекцией.

Наличие ферментов оксидазы и каталазы присуще всем нейссериям и B.catarrhalis в отличии от гемофилов и пневмококков, что может служить дифференцирующим признаком при их идентификации в сочетании с другими (табл.2)

Таблица 2

Свойства основных возбудителей менингитов, учитываемые
через 24 часа от начала бактериологического исследования

┌──────────┬──────────────┬─────────┬──────┬─────┬────────────┬─────────┐

│Морфология│Интенсивность │Изменение│Обра- │Ок- │ Наличие** │Подозре- │

│клеток │роста на │цвета │ботка │раска│ │ваемые │

│ │агаре │"шоколад-│коло- │по │ │микроор- │

│ │ │ного" │нии 3%│Граму│ │ганизмы │

│ │ │агара │КОН* │ │ │ │

│ │ │вокруг │ │ │ │ │

│ │ │колонии │ │ │ │ │

│ ├───────┬──────┤ │ │ ├───┬───┬────┤ │

│ │20% │"шоко-│ │ │ │ок-│ка-│уре-│ │

│ │сыворо-│лад- │ │ │ │си-│та-│азы │ │

│ │точном │ном" │ │ │ │да-│ла-│ │ │

│ │ │ │ │ │ │зы │зы │ │ │

├──────────┼───────┼──────┼─────────┼──────┼─────┼───┼───┼────┼─────────┤

│Капсульные│++++ │++++ │ - │ + │ - │+ │ + │ - │Neisseria│

│полиморф- │ │ │ │ │ │ │ │ │meninqi- │

│ные кокки│ │ │ │ │ │ │ │ │tidis │

│Мелкие по-│- │++++ │ - │ + │ - │- │ + │ + │Haemophi-│

│лиморфные │ │ │ │ │ │ │ │ │lus inf-│

│палочки │ │ │ │ │ │ │ │ │luenzae │

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Капсульные│++++ │++++ │желто- │ - │ + │- │ - │ -│Strepto- │

│удлиненные│ │ │зеленый │ │ │ │ │ │coccus │

│парные │ │ │ │ │ │ │ │ │pneumoni-│

│кокки │ │ │ │ │ │ │ │ │ae │

│Цепочки и │++++ │++++ │зеленый │ - │ + │- │ - │ - │Strepto- │

│пары из │ │ │ │ │ │ │ │ │coccus B,│

│кокков │ │ │ │ │ │ │ │ │D, viri-│

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │dans │

│Мелкие па-│++++ │++++ │зелено- │ - │ + │- │ + │ - │Listeria │

│лочки │ │ │коричне- │ │ │ │ │ │monocyto-│

│"частоко- │ │ │вый │ │ │ │ │ │genes │

│лом" и под│ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│углом │ │ │ │ │ │ │ │ │ │

│Пары и це-│++++ │++++ │ - │ + │ - │- │ + │ + │Acineto- │

│почки кок-│ │ │ │ │ │ │ │ │bacter │

│кобактерий│ │ │ │ │ │ │ │ │calcoace-│

│ │ │ │ │ │ │ │ │ │ticum │

└──────────┴───────┴──────┴─────────┴──────┴─────┴───┴───┴────┴─────────┘

Примечание: * В каплю 3% раствора КОН вносят петлю (колонию) культуры, эмульгируют. Образование в капле студенистой массы, тянущейся за петлей указывает на наличие грамотрицательной флоры (-), крошащуюся консистенцию образует грамположительная флора (+).

** Постановка реакции на оксидазу, каталазу, уреазу. (см. приказ МЗ СССР N 535 от 22.04.85)

Заболевания, где этиологическим агентом являются гемофилы, характеризуются воздушно-капельным механизмом передачи, что обеспечивает им широкое распространение. Из всех представителей этого рода наибольшей патогенностью обладают H.influenzae, впервые описанные Пфейффером в 1892 г. Этот возбудитель имеет несколько специфических серотипов (a, b, c, d, e, f), из которых тип "b" (Hib) является наиболее частым агентом тяжелых генерализованных форм заболеваний, особенно у детей до 5 лет. ГБМ у взрослых могут быть обусловлены другими серологическими типами.

Пневмококки и гемофилы, как и менингококки, являются высокотребовательными к культивированию микроорганизмами. В качестве фактора, способствующего их росту используют кровь различного происхождения. Поэтому универсальной средой для всех возбудителей может служить "шоколадный" агар.

Для проведения бактериологической диагностики гнойных бактериальных менингитов необходимо обеспечить забор материала от больных в полном объеме с соблюдением: сроков забора, доставки патологического материала и условий транспортировки.

В бактериологическую лабораторию доставляется материал в следующем объеме:

1. Ликвор для первичного посева, бактериоскопии и серологических исследований в количестве не менее 1,0 мл.

2. Ликвор в 0,1% полужидком агаре (среда "обогащения") для бактериологического накопления культуры. 0,5 мл ликвора засевается в 5,0 мл полужидкого агара немедленно у постели больного.

3."Толстая капля" крови для бактериоскопии.

4.Кровь в жидкой питательной среде (10.4.4.) или в 0,1% полужидком агаре (среда обогащения) для бактериологического накопления культуры. 5,0 мл крови засевают в 50,0 мл среды обогащения.

5. Кровь в количестве не менее 2-х мл для серологических исследований (РПГА, ВИЭФ, ЛА и др.)

Комментарий ГАРАНТа

См. также микробиологические методы исследования спинномозговой жидкости

Материал для бактериологических и серологических исследований доставляется в бактериологическую лабораторию немедленно после забора в теплом виде (t=37°C) в специально оборудованных контейнерах.

При невозможности немедленной доставки допускается хранение патологического материала в условиях термостата при 37°С в течение 18 часов.

3. Бактериологическое исследование спинномозговой
жидкости больного

3.1. 1-й день исследования. Спинномозговую жидкость (СМЖ) в количестве 2-5 мл берут у больного сразу же при поступлении в стационар (желательно до начала антибактериальной терапии) с соблюдением всех правил асептики. Взятие ликвора проводится персоналом в масках.

Первую порцию СМЖ (около 1,0 мл) берут в отдельную пробирку для проведения общего ликворологического исследования. Вторую порцию, предназначенную для бактериологического исследования наливают в стерильную пробирку (не менее 1,0 мл) и частично засевают в 0,1% полужидкий агар (0,5 мл СМЖ добавляют в 5 мл 0,1% полужидкого агара). Касаться руками краев канюли, иглы и краев пробирок нельзя. Ватно-марлевую пробку полагается держать на весу за ее наружную часть.

СМЖ исследуют немедленно при доставке в лабораторию. Стерильной пастеровской пипеткой со дна пробирки берут 0,3-0,5 мл материала и по 2-3 капли засевают на поверхность 2-х чашек Петри с подогретой питательной средой, растирая шпателем. Одна чашка содержит "шоколадный" агар, вторая - сывороточный. Посевы ставят в термостат при 37°С и создают условия повышенного содержания С02 в атмосфере термостата. Пробирка с ликвором в полужидком агаре инкубируется в термостате.

Нативная спинномозговая жидкость, оставшаяся в пробирке, исследуется в серологических реакциях и используется для приготовления мазков*(1).

Отношение к окраске по Граму у нейссерий выражено недостаточно четко, поэтому они окрашиваются метиленовым синим или по Граму в модификации Калины. Прямая микроскопия окрашенных мазков спинномозговой жидкости в известной части случаев позволяет установить наличие бактерий, вызывающих гнойный менингит. Морфология менингококков описана выше. H.influenzae видна в виде мелких полиморфных грамотрицательных палочек и нитей, окруженных еле заметной нежной капсулой.

Пневмококки имеют вид ланцетовидных диплококков и коротких цепочек, образуют капсулу. Они грамположительны, хорошо красятся всеми анилиновыми красителями, при этом капсула остается неокрашенной и заметна только на окрашенном фоне*(2). Результаты бактериоскопии немедленно сообщают лечащему врачу в виде предварительного ответа. При достаточном количестве исследуемого материала рекомендуется 2-3 капли засеять в чашку с питательной средой для определения чувствительности к антибиотикам.

3.2. 2-й день исследования. Независимо от результатов бактериоскопии ликвора просматривают засеянные чашки. Просмотр чашек ведут визуально и с помощью бинокулярного стереоскопического микроскопа, лупы МБС. Во внимание принимают все колонии. Чашки с отсутствием роста инкубируют одни сутки. Готовят препараты-мазки, окрашивают, ставят реакцию с 3% раствором КОН и биохимические тесты - на оксидазу, каталазу, уреазу. Гемофилам присущ резкий специфический запах, исходящий от посевов.

Морфология менингококковых колоний на сывороточном агаре описана во всех руководствах по микробиологии. На "шоколадном" arape колонии нежные, сероватого цвета, с блестящей поверхностью и ровными краями, имеют маслянистую консистенцию, размерами от 0,1 до 3,0 мм. Менингококки не меняют цвета Среды. На основании микроскопии мазков из колоний и результатов первичных биологических тестов возможна выдача предварительного ответа. Если в мазках обнаружены грамотрицательные кокки, это дает право отнести их к роду нейссерий и провести дифференциацию видов.

Гемофилы на "шоколадном" агаре дают довольно обильный рост. Колонии серого цвета, плоские диаметром 0,2-2,0 мм. легко снимаются со среды. В мазках, окрашенных по Граму, видны мелкие короткие грамотрицательные палочки с капсулой разной степени выраженности, а также нити разной длины и короткие цепочки. На сывороточном arape H.influenzae не растет*(3). Крупные (3-5 мм колонии, содержащие грамотрицательные палочки, подозрительны на энтеробактерии. Candida и P.aeruginosa растут обильно на всех средах, не изменяя цвета "шоколадного" агара.

Колонии пневмококков на обеих средах - мелкие (диаметром 0,1-1,0 мм), иногда плоские, с вдавлением в центре. На "шоколадном" агаре они окружены зоной желто-зеленого гемолиза (тип альфагемолиза). По внешнему виду колонии пневмококков на обеих средах трудно отличить от колоний стрептококков группы В, зеленящих стрептококков, энтерококков (S.feacalis), которые в редких случаях могут вызвать менингит, особенно у детей 1 года.

В мазках из колоний пневмококки имеют овальную или шаровидную форму, располагаются парами или в виде коротких цепочек из 2-3 пар. Если имеется обильный рост одинаковых колоний, то допустим одномоментный отсев на дифференциально-диагностические среды, изучение культуры по ряду признаков и антибиотикочувствительности (табл.1,2). Определение чувствительности энтеробактерий и стафилококков проводят на среде АГВ. Эта среда служит основой для определения чувствительности к антибиотикам менингококков при добавлении 20% сыворотки. H.influenzae и пневмококков - при добавлении соответствующего количества крови. Приготовление питательных сред и постановка теста на антибиотикочувствительность производится в соответствии с действующими указаниями*(4).

В таблице 2 суммировано минимальное число признаков, достаточное для того, чтобы выделенные из СМЖ бактерии предположительно отнести к тому или иному таксону (от семейства до вида) и избрать дальнейший путь идентификации. На этом этапе возможна выдача окончательного ответа, при положительной реакции со специфическими антисыворотками для H.inftuenzae, N.meningitidis и Str.pneumoniae.

Колонии, подозрительные на менингококки, отсевают на скошенный сывороточный агар или сектор чашки и инкубируют при 37°С.

Колонии, подозрительные на пневмококки, стрептококки и др. отсевают на 2 сектора кровяного агара (с 5% крови) для последующего определения чувствительности к желчи и постановки тестов на лекарственную чувствительность.

Если число выросших колоний мало (1-2), то их отсевают на чашку с сывороточным или "шоколадным" агаром для накопления микробной массы, а идентификацию микроба проводят еще через одни сутки.

При менингитах новорожденных и детей раннего возраста, а также изредка и в других возрастных группах, помимо трех перечисленных видов микроорганизмов этиологическими факторами могут быть энтеробактерии (E.coli, S.marcescens, K.pneumoniae, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter), синегнойная палочка (P.aeruginosa), Acinetobacter calcoaceticum, Listeria monocytogenes, различные стрептококки - гемолитические группы В, "зеленящие" и энтерококки, а также стафилококки (золотистый и эпидермальный) и грибы рода Candida.

При подозрении на энтеробактерии*(5), синегнойную палочку*(6), стафилококк*(7) и Ac.calcoaceticum проводят исследования в соответствии с имеющимися методическими материалами *(8)

При подозрении на листерии в этот день, если число колоний позволяет, ставят ряд проб, а также тест на чувствительность к антибиотикам. Для L.monocytogenes помимо признаков, указанных в табл.2 характерно: подвижность при комнатной температуре, разложение мальтозы, глюкозы, инактивность по отношению к дульциту, манниту, сорбиту и арабинозе. Сахароза и глицерин разлагаются медленно. L.monocytogenes образует краевую зону гемолиза на агаре с 5% бараньей крови, разлитом слоем 3 мм.

Для идентификации Candida albicans делают посев из подозрительных белых выпуклых колоний, состоящих из дрожжевых клеток, на среду Сабуро или мясо-пептонный агар, содержащий по 100 Ме/мл пенициллина и стрептомицина.

Если прямой посев на чашки с питательной средой не дал роста колоний, то делается высев на чашки с сывороточным, "шоколадным" агаром из инкубированной в термостате смеси ликвора с полужидким агаром (среда "обогащения").

При отрицательных результатах высев со среды "обогащения" повторяют через 1-2 дня в течение 5 дней инкубации в термостате.

При получении роста колоний исследование их проводят тем же путем, что и при прямом посеве спинномозговой жидкости.

3.3 3-й день исследования. Культуры, отсеянные из отдельных колоний, просматривают под МБС и ставят пробу с 3% раствором КОН. Для оценки чистоты выросшей культуры готовят мазки и просматривают. При обнаружении морфологически типичных грамотрицательных кокков, проводят идентификацию (см.табл.1), серогруппирование идентифицированной культуры, а также используют эту культуру для определения лекарственной устойчивости (если эти тесты не были сделаны на 2-й день).

Учитывают результаты посевов, сделанных на 2-й день исследования. На этом этапе возможна выдача окончательного положительного ответа для менингококков и др. микроорганизмов (кроме пневмококков и стрептококков).

Для дифференциации пневмококков, зеленящих и фекальных стрептококков (энтерококков) по микроскопии чистых культур на секторах кровяного агара учитывают характер гемолиза вокруг выросших колоний и ставят дополнительные пробы*(9) (см.табл.3).

Таблица 3

Понравилась статья? Добавь ее в закладку (CTRL+D) и не забудь поделиться с друзьями: