Показания к проведению серологических исследований

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА) с менингококковыми эритроцитарными диагностикумами*(15) серогрупп А, В и С проводят в следующих случаях:

а) как дополнительный метод диагностики менингококковой инфекции. Обязательным требованием является исследование сывороток крови от больных, взятых в разные сроки от начала заболевания, т.е. в динамике (в начале заболевания, на 7 и 15 день болезни).

б) для ретроспективного выявления локализованных форм менингококковой инфекции в очагах заболевания;

в) при проведении иммуно-эпидемиологических исследований среди населения с целью определения соотношения серонегативных и серопозитивных контингентов;

г) при оценке иммунологической эффективности противоменингококковой вакцинации.

2. Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)
с эритроцитарными менингококковыми диагностикумами

Реакцию непрямой гемагглютинации можно ставить как макро-, так и микрометодом, причем, в последнем случае используют только микротитраторы системы "Такачи".

Различия между этими методами заключаются лишь в объемах используемых ингредиентов и сроках учета результатов реакции. При макрометоде реагирующая смесь в каждой лунке состоит из 0,5 мл соответствующего разведения сыворотки крови и 0,25 мл диагностикума. В микрометоде объемы соответственно уменьшаются: 0,05 мл сыворотки и 0,025 мл диагностикума.

Учет результатов исследования в микротитраторе проводят спустя 2 часа инкубации в термостате; при макрометоде иногда требуется дополнительная экспозиция в течение 1-2 часов при комнатной температуре.

При постановке РНГА можно использовать многоканальные пипетманы с указанными объемами ингредиентов.

2.1. Необходимые реагенты и приборы:

- эритроцитарные менингококковые серогруппы А, В и С диагностикумы;

- сыворотки диагностические менингококковые группоспецифические А, В и С *(16);

- нормальная кроличья сыворотка*(17), сухая кроличья плазма или бычий сывороточный альбумин*(18);

- исследуемый материал (сыворотка крови человека);

- полистироловые пластины с лунками, серологические пробирки или микротитраторы с V-образными лунками (системы "Такачи");

- термостат для поддержания температуры 37°С;

- водяная баня для поддержания температуры 56°С;

- потенциометр для измерения рН растворов;

- пипетки стеклянные мерные (ГОСТ 20-292-74);

- дозаторы пипеточные П1 на 0,5; 0,05 (2Т2.933.053 ТО);

- хлорид натрия (NaCl),

- натрий фосфорно-кислый двузамещенный (Nа2НРО4-12H2O);

- калий фосфорно-кислый однозамещенный (КН2Р04);

- дистиллированная вода.

2.2. Подготовка ингредиентов.

2.2.1. Приготовление исходного забуференного физиологического раствора рН 7,2 (ЗФР).

В 0,5 л дистиллированной воды растворяют:

хлорида натрия (NaCl) - 8,65 г

натрия фосфорно-кислого двузамещенного (Na2HPO4х2Н2О) - 1,92 г

калия фосфорно-кислого

однозамещенного (КН2РО4) - 0,44 г

Объем раствора доводят до 1 л дистиллированной водой.

После растворения солей проверяют рН раствора, который должен быть равен 7.2. Раствор фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы и стерилизуют при 0,5 атм. 30 минут.

ЗФР необходим для приготовления стабилизирующего буфера, в котором проводят титрование исследуемых сывороток крови.

2.2.2. Стабилизирующий буфер.

В качестве стабилизатора можно применять нормальную кроличью сыворотку (НКС), сухую кроличью плазму или бычий сывороточный альбумин (БСА).

Используемая НКС не должна давать неспецифической (спонтанной) реакции гемагглютинации с эритроцитарными диагностикумами. Инактивированную при +56°С в течение 30 минут НКС или плазму добавляют к ЗФР из расчета 1,0 мл на 100,0 мл (получают 1% раствор), БСА не инактивируют. Концентрация БСА в ЗФР - 0,5%.

2.2.3. Взятие крови.

Для проведения серологических исследований кровь от больных ГФМИ или с подозрением на эту инфекцию забирают из локтевой вены с соблюдением обычных правил асептики: при массовых серологических исследованиях кровь берут из пальца.

После образования сгустка, полученную сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильную посуду (пробирки, ампулы). Хранят сыворотку крови в холодильнике при +4°С. В реакции исследуют сыворотки крови без признаков пророста.

Перед постановкой РНГА сыворотки разводят 1:5 исходным буфером (ЗФР). Титрование сывороток проводят в стабилизирующем буфере.