Белки мышечной ткани

Ц е л и р а б о т ы:

1.Изучить состав белковых фракций мышечной ткани рыбы.

2.Освоить методы фракционирования белковых фракций мышечной ткани.

3.Мясо рыбы представлено в основном мышечной тканью, которая составляет в основном 40-65% массы рыбы. Мышца состоит из мышечных волокон, представляющих собой многоядерные клетки.

4.Основными составными частями мышечного волокна являются:

- сарколемма (наружная мембрана);

- саркоплазма (цитоплазма);

- ядра;

- миофибриллы;

- митохондрии.

Миофибриллы состоят из саркомеров. Саркомер - сократительный элемент миофибрилл. Сокращение саркомера происходит за счет скольжения относительно друг друга белков актина и миозина и образования между ними актомиозинового комплекса.

Белки мышечной ткани рыбы подразделяются на следующие фракции:

- белки миофибриллярной фракции;

- белки саркоплазматической фракции;

- белки сарколеммы;

- белки ядер.

Таблица 8

Фракция	w фракции в мышечной ткани, %	Раствори- мость	Белки	w белков %
Миофибрил- лярная		В солевых растворах с высокой ионной силой	Миозин Актин Актомиозин Тропонин Тропомиозин	30-40 15-20 - 2-3
Саркоплазма- тическая	20-30	В солевых растворах с низкой ион- ной силой	Миоген Миоглобин Х-глобулин Миоальбумин	4-6 1-2 8-15 5-7
Белки сарко- леммы		В щелочах	Коллаген Эластин
Ядерная		В щелочах	Нуклеопротеиды (белки - протамины, гистоны)

Оборудование, реактивы:

Ткань мышечная гидробионтов; диализатор; ступка с пестиком; марля; фильтры; баня водяная; центрифуга.

Реактивы:

- для выделения миофибриллярной фракции: KCl (насыщенный раствор), KCl или NaCl (0.6 М раствор); ацетон;

- для выделения и диолиза саркоплазматической фракции: KCl (0,03 М раствор); NaOH (10%-й раствор); AgNO₃; реактив биуретовый; (NH₄)₂SO₄ (порошок);

- для анализа белков сарколемы: NaOH (0,25%-й раствор);

- для анализа нуклеопротеидов (см. лабораторную работу № 8).

Порядок выполнения работы:

1. Анализ белков саркоплазматической фракции

1.1. Выделение саркоплазматической фракции.

Саркоплазматическая фракция растворяется в солевых растворах с низкой ионной силой (0,03 М KCl или 0,03 М NaCl).

В ступке с 50 мл 0,03 М KCl (или NaCl) настаивают 10 г тщательно измельченной мышечной ткани. Образуется однородная масса, которую фильтруют через двойной слой марли. Мутный фильтрат повторно фильтруют через бумажный фильтр. Получают 20-30 мл прозрачного розового фильтрата № 1. Данная солевая вытяжка мышечной ткани содержит белки саркоплазматической фракции (альбумины и глобулины). Осадок № 1 содержит остальные белковые фракции.

1.2. Диализ фильтрата № 1.

Диализ состоит в том, что через поры полупроницаемой мембраны проходят молекулы и ионы низкомолекулярных соединений, белковые молекулы не способны проходить через поры. В данной работе диализ используется для выделения из фильтрата NaCl. Дальнейшее отделение альбуминов от глобулинов основано на их различной растворимости в воде и солевых растворах. Альбумины растворяются в воде и высококонцентрированных растворах солей, осаждаются при насыщении раствора солью более 50%.

Глобулины растворимы в растворах солей средней концентрации (6-15%).

При более высокой или при более низкой концентрации растворимость глобулинов уменьшается.

Для проведения диализа используют специальные приборы - диализаторы, простейшим из которых является целлофановый пакет, помещенный в стакан с дистиллированной водой.

Вырезают из целлофана круг диаметром 9-12 см и складывают его в форме мешочка. Вставляют в отверстие стеклянную трубку (длиной 5 см и диаметром

0,8 см), верхний конец трубки должен выступать из мешочка на 1/3 длины. Мешочек туго закрепляют на трубке ниткой. Через трубку вводят в диализатор

10 мл фильтрата № 1 и погружают его в стакан с дистиллированной водой.

Через поры в воду начинают переходить хлорид-ионы Cl^- из фильтрата. Через 10 мин из стакана пипеткой отбирают 1 мл H₂O и проделывают качественную реакцию на Cl^-, подтверждающую диализ:

AgNO₃ + NaCl = AgCl + NaNO₃

Меняют воду в стакане. Диализ ведут в течение двух часов. Каждые 10 мин проверяют наличие хлорид-ионов и меняют воду в стакане.

Завершение диализа фиксируется отрицательной реакцией на Cl^—ионы, что свидетельствует о полной диффузии соли из диализатора через поры в стакан.

Таким образом, фильтрат № 1 содержит только белки и воду. После удаления NaCl фильтрат № 1 мутнеет, так как глобулины не растворяются в воде и выпадают в осадок. Содержимое диализатора фильтруют, в осадке остаются глобулины, в полученном фильтрате № 2 находятся альбумины. Биуретовая реакция фиксирует наличие белков в обеих фазах. Для осаждения альбуминов к фильтрату № 2 добавляют порошок сульфата аммония (NH₄)₂SO₄ до полного насыщения раствора. Наблюдается выпадение альбуминов в осадок. Осадок отфильтровывают. При условии полного насыщения сульфатом аммония фильтрат не дает биуретовой реакции, что подтверждает полное выпадение альбуминов в осадок.

2. Выделение белков миофибриллярной фракции.

К осадку № 1 (после отделения саркоплазматической фракции) добавляют 40 мл 0,6 М KCl, настаивают 10-15 мин. В раствор переходит миозин. Раствор фильтруют, отделяя фильтрат с миозином. Далее к осадку снова добавляют

40 мл 0,6 М KCl. При более длительной экстракции в раствор переходит актин. Раствор фильтруют. К фильтрату добавляют ацетон, который осаждает актин. Далее к осадку снова добавляют 40 мл 0,6 М KCl. При экстракции 0,6 М

KCl в течение суток в раствор переходит актомиозин, раствор снова фильтруют. При добавлении к осадку насыщенного раствора KCl можно выделить тропомиозин. Снова фильтруют или центрифугируют, получают осадок № 2 после определения миофибриллярной фракции.

3. К осадку № 2 добавляют 50 мл 0,25%-го раствора NaOH и оставляют на 12 ч.

Далее жидкую массу центрифугируют. В осадке № 3 остаются белки стромы, в фугате (фильтрате № 3) - белки ядер (нуклеопротеиды). Осадок № 3 помещают в стакан, добавляют 50 мл воды и кипятят в течение часа, периодически добавляя воду. Далее горячую жидкость отфильтровывают. В фильтрате находится желатина (продукт гидролиза коллагена), что подтверждается биуретовой реакцией.

4. Анализ белков ядер.

Фильтрат № 3 содержит белки ядер - нуклеопротеиды. Анализ нуклеопротеидов проводят аналогично анализу в работе № 8 «Нуклеопротеиды».