Методом Къельдаля

Ц е л ь р а б о т ы - количественно определить содержание белка в мышечной ткани.

Метод Къельдаля включает следующие этапы:

1. Минерализация биологического материала – ожигание мышечной ткани в присутствии концентрированной серной кислоты при нагревании. Происходит переход азота органических соединений в аммиак:

Белок + KH₂SO₄ n(NH₄)₂SO₄ + n₂SO₄ + n₃CO₂ + n₄H₂O

2. Получение NH₄OH:

(NH₄)₂SO₄ + 2NaOH 2 NH₄OH + Na₂SO₄

3. Термическая перегонка NH₄OH с водяным паром:

4. Количественное определение NH₄OH методом обратного титрования:

2 NH₄OH + H₂SO₄ (NH₄)₂SO₄ + 2 H₂O

5. Расчет содержания сырого протеина:

m(сырого протеина) = m(N)*6,25,

где m(N) - содержание общего азота; 6, 25 - коэффициент пересчета азота на сырой протеин.

Для мяса рыбы характерно высокое содержание небелковых азотсодержащих веществ. Для определения содержания истинного протеина в формулу вносят поправку на небелковый азот:

m(истинного протеина) = m(БА)*6,25 = (m(ОА) - m(НБА)*6,25,

где m(ОА) - содержание общего азота; m(НБА) - небелковый азот; m(БА) - белковый азот.

Оборудование, реактивы:

Аппарат для отгонки с водяным паром (рис.1); колба Къельдаля для минерализации пробы на 50-100 мл; колба Къельдаля для отгонки на 500-1000 мл; установка для титрования; цилиндры мерные; колбы конические; бумага

индикаторная; кислота серная (конц.); K₂SO₄ (крист.);

CuSO_4*5H₂O (крист.); перекись водорода (конц.); гидроксид натрия (30%-й); гидроксид натрия (0,1н); кислота серная (0,1 н); метиловый красный (0,05%-й); вода (дистил.).

Порядок выполнения работы:

1. Минерализация биологического материала.

Взвешивают 0,2-0,3 г тонко измельченной мышечной ткани. Во избежание потерь вещества на стенках горлышка колбы помещают взвешенный образец в короткий закрытый с одного конца пакетик из фильтровальной бумаги. Пакетик вносят в колбу Къельдаля емкостью 50-100 мл. Далее в колбу Къельдаля добавляют в качестве катализатора 0,2-0,5 г сульфата меди CuSO_4*5H₂O, 0,2-0,3 г сульфата калия K₂SO₄ и 1 мл концентрированной перекиси водорода H₂O₂. К содержимому добавляют 5-6 мл концентрированной H₂ SO₄.

Колбу осторожно нагревают до кипения жидкости. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость в колбе Къельдаля не станет прозрачной (с голубоватым или зеленоватым оттенком). По окончании сжигания смесь охлаждают.

2. Термическая перегонка NH₃ с водяным паром.

Готовят установку для перегонки NH₃ с водяным паром, предварительно нагревают паровик. Для сжигания содержимое колбы Къельдаля переносят в колбу для отгонки вместимостью 0,5-1,0 л с помощью дистиллированной воды так, чтобы объем жидкости в колбе для отгонки занимал не белее 1/5 объема колбы. Прежде чем приступить к отгонке NH₃, в приемную колбу емкостью 250 мл приливают из бюретки 30 мл 0,1 н раствора H₂SO₄ (в избытке). В начале перегонки приемную колбу устанавливают так, чтобы конец алонжа, соединенного с холодильником, был погружен в раствор серной кислоты.

Далее в перегонную колбу осторожно, по стенке, вливают 80 мл 33%-го раствора NaOH. Приемную колбу быстро закрывают пробкой, соединенной с нагретым до кипения парообразователем и прямым холодильником. Аммиак с поступающим из парообразователя паром, начинает перегоняться в приемную колбу.

После 5-10 мин отгонки носик алонжа вынимают из 0,1 н раствора серной кислоты в приемной колбе и фиксируют его на расстоянии 2-3 см от уровня жидкости.

Отгонку ведут в течение 30-40 мин. Конец перегонки определяют с помощью индикаторной бумаги, которую подносят к концу алонжа, не касаясь его. Если pH > 7, то перегонку продолжают. По окончании отгонки приемную колбу отделяют от установки и охлаждают.

3. Титрование.

Избыток серной кислоты в приемной колбе оттитровывают 0,1 н раствором гидроксида натрия. В качестве индикатора применяют метиловый красный.

Параллельно с рабочим опытом проводят контрольный опыт - без навески мышечной ткани проделывают все операции, начиная со сжигания. Для проверки титра кислоты в чистую колбу наливают 30 мл 0,1 н раствора H₂SO₄ и оттитровывают его 0,1 н раствором NaOH, используя индикатор метиловый красный.

Содержание сырого протеина рассчитывают по формуле:

w(белка) = (а – в) 0,0014_*6,25

m ^* 100%,

где w – массовая доля сырого протеина, %; а - объем 0,1 н раствора NaOH, израсходованный на титрование избытка H₂SO₄ в рабочем опыте, мл; 0,0014 - количество азота, эквивалентное 1 мл 0,1 н раствора NaOH, г; 6,25 - коэффициент пересчета общего азота на белок; m - масса навески.