Анализ химического состава нуклеопротеидов

Ц е л ь р а б о т ы - изучить химический состав нуклеопротеидов.

Нуклеопротеиды - сложные белки. Небелковый компонент нуклеопротеидов - нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК), белковый - протамины, гистоны. Нуклеопротеиды осуществляют генетическую функцию.

Нуклеиновые кислоты - биологические полимеры, мономерами которых являются нуклеотиды. Нуклеотиды состоят из трех частей:

Азотистых оснований, пентоз, фосфорной кислоты.

К азотистым основаниям относятся: пуриновые и пиримидиновые основания; пуриновые (аденин, гуанин) являются производными гетероцикла пурина; пиримидиновые основания (тимин, урацил, цитозин) - производные пиримидина. Пентозы - рибоза, дезоксирибоза.

Оборудование, реактивы:

Ступка фарфоровая; центрифуга; баня водяная; кислота серная (10%-й раствор); гидроксид натрия (10%-й раствор); сульфат меди (1%-й раствор); нитрат серебра (1%-й раствор); аммиак (конц.); гидроксид натрия (30%-й раствор); сульфат меди (1%-й раствор); кислота фосфорная (10%-й раствор); реактив молибденовый; молибдат хинолина; кислота уксусная (5%-й раствор); эфир; песок.

Приготовление молибденового реактива: 7,5 г молибдата аммония растворяют в 50 мл концентрированной азотной кислоты.

Приготовление раствора молибдата хинолина: раствор 1 готовят растворением 70 г молибдата натрия в 150 мл дистиллированной воды; раствор 2 готовят растворением 60 г лимонной кислоты H₃C₆H₅O₇ в 150 мл

дистиллированной воды. К полученному раствору добавить 85 мл HNO₃.

Смесь растворов 1 и 2 получают, добавляя к раствору 1 раствор 2 при непрерывном перемешивании стеклянной палочкой.

Раствор 3 готовят следующим образом: к 100 мл Н₂О добавляют 30 мл азотной кислоты и 5 мл хинолина. Раствор молибдата хинолина готовят, постепенно добавляя раствор 3 к смеси растворов 1 и 2 при непрерывном

Перемешивании, выдерживают 24 часа при комнатной температуре. Раствор фильтруют в мерную колбу объемом 1000 мл, добавляют 280 мл ацетона и доводят водой до метки. Раствор хранят в темном месте в течение трех месяцев.

Порядок выполнения работы:

1. Извлечение нуклеопротеидов из мышечной ткани.

В фарфоровую ступку помещают 1 г мышечной ткани, добавляют 1 каплю эфира, 2 капли воды, 0,1 г стеклянного песка. Массу растирают пестиком в течение 2 минут. Добавляют 4 мл раствора NaOH. Переносят

содержимое ступки в центрифужную пробирку.Центрифугируют в течение 10 минут. Надосадочный раствор, содержащий нуклеопротеиды, переносят в стакан, добавляют 2 мл 5%-го раствора уксусной ки

слоты. Нуклеопротеиды выпадают в осадок. Содержимое стакана переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин. Осадок нуклеопротеидов подвергают гидролизу.

2. Гидролиз нуклеопротеидов.

В широкую пробирку с обратным холодильником помещают полученный осадок нуклеопротеидов, добавляют 4 мл 10%-го раствора H₂SO₄. Пробирку с обратным холодильником нагревают на водяной бане 1-1,5 часа.

Далее жидкость охлаждают и фильтруют. Фильтрат (гидролизат) анализируют, обнаруживая продукты гидролиза нуклеопротеидов - полипептиды, пуриновые основания, рибозу, дезоксирибозу, фосфорную кислоту.

3. Биуретовая проба на пептидные связи.

Помещают в пробирку 1 мл гидролизата, добавляют 0,5 мл биуретового реактива. Образование сине-фиолетового комплекса свидетельствует о наличии полипептидов - продуктов гидролиза простых белков протаминов и гистонов (белковых компоненитов нуклеопротеидов).

4. Серебряная проба на пуриновые основания.

Помещают в пробирку 0,5 мл гидролизата, добавляют 1 каплю концентрированного аммиака и пять капель 1%-го раствора нитрата серебра. Через 5 мин. Наблюдается выпадение бурого осадка серебряных соединений пуриновых оснований (аденина, гуанина).

5.Проба Троммера-Фелинга на пентозы.

К пяти каплям гидролизата добавляют 10 капель 30%-го раствора гидроксида натрия и 1-3 капли 7%-го раствора сульфата меди. Наблюдается образование гидроксида меди Cu(OH)₂. Жидкость перемешивают и нагревают до начала кипения. Наблюдается образование красного осадка

Cu₂O или желтого СuOH. Из-за большого количества примесей содержимое пробирки приобретает темно-коричневый цвет:

CuSO₄ + 2NaOH Cu(OH)₂ + Na₂SO₄

H - C = O COOH

| |

H - C - OH H - C - OH

| |

H - C - OH + 2Cu(OH)₂H-C-OH +2CuOH

| | Гидрат

H - C - OH H-C-OH закиси

| | меди (1)

H - CH₂OH CH₂OH

Рибоза Рибоновая кислота

2СuOH Cu₂O + H₂O

Желтый осадок Кирпично-красный

осадок (оксид меди(1)).

Избыток CuSO₄ помешает реакции, так как ведет к образованию большого количества Cu(OH)₂, который при нагревании распадается с образованием черного осадка оксида меди (П):

Сu(OH)₂CuO + H₂O

Голубой Черный

осадок осадок

6. Молибденовая проба на фосфорную кислоту.

Помещают в пробирку 1 мл молибденового реактива, добавляют 2-3 капли гидролизата, нагревают в течение 10 мин. В присутствии фосфорной кислоты жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаждении выпадает желтый кристаллический осадок комплексов фосфорномолибденовокислого аммония:

12(NH₄)₂MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃ (NH₄)₃PO₄ + 12MoO₃ + 21NH₄NO₃ + 12H₂O.

Определение фосфорной кислоты можно проводить с помощью молибдата хинолина, при этом наблюдается выпадение ярко-желтого кристаллического осадка фосформолибдата хинолина:

12(C₉ H₇ON)₂MoO₄ + H₃PO₄ + 21HNO₃молибдат хинолина