Транспозиции

Рекомбинационные процессы еще одного типа - транспозиции лежат в основе пере­мещений подвижных генетических элементов. Подвижные эле­менты - это особые последовательности ДНК, способные, как это следует из их названия, к перемещениям из одного участка молекулы ДНК (хромосомы или плазмиды) в другой, или в другую моле­кулу в той же клетке, или даже в клетки другого организма. Они широко распространены как у прокариот, так и у эу­кариот и при этом отличаются высоким разнообразием. Под­вижные элементы, как правило, не существуют автономно, и для них характерно нахож­дение в составе хромосом или плазмид. В большинстве своем подвижные элементы про­кариот и эукариот построены по сходному плану и состоят из центральной части, флан­кированной концевыми обращенными повторами (рис. 4).

Транспозиции осуществляются особыми белками, ген (или гены) которых в основ­ном локали­зован в самих подвижных элементах, в их центральной части. Главный белок транспозиции - транспозаза. Рекомбинация между под­вижным элементом и той ДНК, в которую он будет встраи­ваться (ее называют ДНК-мишенью), происходит на уровне дуп­лексов, не имеющих, как и в слу­чае сайт-специфической рекомбинации, пресинаптиче­ских фиксированных по­вреждений. По­скольку рекомбинация происходит точно по кон­цам подвиж­ного элемента, транспозиции можно рассматривать как сайт-специфический процесс, но только в отношении самого элемента, так как встраивание эле­ментов в ДНК-мишень чаще всего происходит в случайные сайты. Важно от­ме­тить, что сколько-нибудь заметная гомология между подвижным элементом и ДНК-мишенью от­сутствует.

Некоторые подвижные элементы бактерий содержат в центральной части также гены, не имеющие отношения к транспозиции, чаще всего это факторы устойчивости к антибиотикам, ле­карственным веществам или ядам. Такие эле­менты при их открытии по­лучили название транс­позонов (Tn); к ним относятся представленные на рис. 4 Tn3 и Tn5. Позднее так стали называть все подвиж­ные элементы. Подвижные элементы с короткими обращенными повторами (рис. 4, а) характерны для бактерий, растений и дрозофилы. Элементы с длин­ными обращенными повто­рами (рис. 4, б) описаны у бактерий. Эти длинные повторы, в свою очередь, представляют собой один из типов более просто устроенных подвижных элементов, называемых IS (insertion sequences). В этих случаях центральная часть такого сложного транспозона содержит только по­сторонние гены, а гены транспозиции находятся в IS-элементах, причем один из них инактивиро­ван одной или более мутациями. У эукариот (дрожжей, простейших, насекомых, позвоночных, выс­ших растений) распространены подвижные элементы, получившие название ретротранс­по­зонов (рис. 4, в). Структура ретротранспозонов соответствует ДНК-копиям геномов ретровиру­сов позвоночных, которые также являются подвижными элементами. В транс­позициях ретротранспо­зонов задействованы фермент - обратная транскриптаза и РНК-ко­пия элемента в качестве интер­медиата (см. ниже). Ретротранспозоны подразделяются на две группы. К первой относятся эле­менты с длинными пря­мыми повторами на концах. Вторую группу образуют элементы, не имею­щие повторов на концах.

Обращенные концевые повторы абсолютно необходимы для транспози­ции, по­скольку именно их концы связываются транспозазой и по ним проис­ходит рекомбинация. У умеренного фага Mu, обладающего всеми свойствами подвижного элемента, обращен­ные концевые повторы состоят всего из 2 п.н. У ретротранспозонов первой группы длин­ные прямые повторы также заканчива­ются обращенными повторами из 2 п.н., но не­сколько дальше от концов эле­ментов и у рет­ротранспозонов, и у фага Mu имеются допол­нительные обра­щенные повторы.

Все мобильные элементы за некоторыми исключениями на обоих концах содержат еще и пря­мые повторы из нескольких нуклеотидов ДНК-мишени. Состав этих нуклеоти­дов варьирует, так как подвижные элементы внедряются в случайные сайты ДНК-мишени, но их число постоянно для каждого элемента. Чаще всего оно равно 5 или 9. Механизм образования прямых повторов будет разъяснен немного позже. Таковы общие представ­ления о структуре подвиж­ных элемен­тов.

Структура подвижных элементов определяет механизмы их перемеще­ний. Можно выделить три основных механизма рекомбинации при транспози­циях: репликативная транспозиция, нереп­ликативная транспозиция и переме­щение ретротранспозонов. Они будут рассмотрены чуть позже. А сначала от­метим, что, хотя эти механизмы различаются в деталях, имеется общий прин­цип реакций транспозиции (рис. 5). Процесс происходит в несколько этапов. Сначала транс­позаза (у ретротранспозонов ее называют интегразой) сводит вместе концы подвижного эле­мента и делает разрывы точно по этим концам, либо в обеих цепях, как в случае нерепликатив­ной транспозиции, либо в од­ной из цепей, как при репликативной транспозиции и при интеграции ДНК ретротранспозонов (рис. 5, а). Затем транспозаза сводит в контакт концы эле­мента и дуп­лекс ДНК-мишени. При этом она делает в обеих цепях ДНК-ми­шени ступенчатые разрывы (рис. 5, б), отстоящие друг от друга на столько п.н., сколько их обнаруживается в прямом повторе ДНК-мишени у данного элемента. Следующий этап - обмен цепями, приводящий к рекомбинации ме­жду ДНК элемента и мишени. 3'-OH-концы элемента соединяются с 5'-P-кон­цами мишени, ос­тавляя за счет ступенчатости разрывов бреши между 5'-P-концами элемента и 3'-OH-концами мишени (рис. 5, в). Катализируемое транспозазой расщепление и замыкание концов цепей ДНК происходят без потери энергии фосфодиэфирной связи и не требуют АТФ, что напоминает кон­серва­тивную сайт-специфическую рекомбинацию. Но сказанное не отно­сится к брешам, которые на следующем этапе заполняются путем репаратив­ной реп­ликации ДНК по матрице ДНК-мишени (рис. 5, г). Репаративная реп­ликация и леги­рование оставшегося после нее одноцепочечного разрыва тре­буют допол­нительных за­трат энергии. Обратим внимание на то, что заполне­ние брешей является причиной воз­никновения описанных выше прямых повто­ров ДНК-ми­шени на концах элемента (рис. 5, д). Таким образом, мы разо­брали общую ос­нову транспозиционной ре­комбинации.

Теперь рассмотрим детали. Основные механизмы транспозиций изобра­жены на рис. 6. Репли­кативная транспозиция (рис. 6, а) отличается тем, что подвижный элемент, пере­мещаясь в дру­гую молекулу, оставляет свою копию в исходной ДНК. Это может произойти только за счет уд­воения (репликации) элемента. При этом кольцевые ДНК донора и ми­шени сливаются, образуя ко­интеграт, в котором последовательности обеих молекул раз­делены двумя ко­пиями элемента, расположенными в одной ориентации. Вслед за этим проис­ходит разрешение коинтеграта на ис­ходные молекулы, каждая из которых со­дер­жит копию элемента. Последняя реакция осуществ­ляется по механизму сайт-специфиче­ской рекомбинации ферментом резолвазой, которая входит в ту же группу сайт-специ­фических топоизомераз, что и инвертазы. Но резол­ваза отличается тем, что использует имеющиеся внутри элементов реком­бина­ционные сайты, если они нахо­дятся в одинако­вой ориентации. В преды­дущей статье уже говорилось о том, что гомологичная рекомби­нация между повто­рами ДНК, расположенными в одной ориентации, приводит к делеции мате­риала, заключенного между повторами. Так и здесь сайт-специфическая ре­комбина­ция ме­жду двумя прямыми повторами подвижного элемента приво­дит как бы к делеции из коинтеграта одной из плазмид, составляющих коин­теграт, вместе с одной копией подвижного элемента. Это и есть разрешение коинте­грата. Репликативная транспозиция - относительно редкий механизм. Он об­наружен у фага Mu и бактериальных транспозонов семейства Tn3 с ко­роткими обращенными повторами.

Неконсервативная транспозиция (рис. 6, б) заключается в вырезании эле­мента и его переме­щении в новое место. Этот механизм характерен для большинства подвижных элементов бакте­рий и эукариотических элементов с короткими обращенными повторами. Как уже указывалось, у ретротранспозо­нов с длинными концевыми повторами транспози­ция происходит по схеме, вклю­чающей РНК-интермедиат. В этом процессе участвуют специальные фер­менты, кодируемые са­мими ретротранспозонами (см. рис. 4, в). В их централь­ной части расположен ген pol, кодирую­щий несколько необходимых для транс­позиции ферментов: интегразу, обратную транскриптазу и РНКазу H, ко­торые первона­чально образуются в виде общего белка, а потом нарезаются на от­дельные белки под действием специальной протеазы, также кодируемой ге­ном pol. Схема транспозиции дана на рис. 6, в. С геномной ДНК элемента транскрибируется РНК-копия, но уже с ко­роткими концевыми прямыми повто­рами, с нее путем обратной транскрипции синтези­руется ДНК-копия с длин­ными повторами, которая встраивается в новое место с помощью интегразы. Рекомбинация у ретроэлементов без концевых повторов менее изучена, но она также осуществ­ляется через РНК-интермедиат.