Лабораторная диагностика антифосфолипидного синдрома и волчаночного антикоагулянта (см. также «Тромбозы. Волчаночныи антикоагулянт»)

При антифосфолипидном синдроме в крови циркулируют антитела против фосфолипидов или фосфолипид-связанных белков. При этом синдро­ме возникает лабораторный феномен, при кото­ром происходит удлинение времени свертывания крови в тестах, выполняемых на фосфолипидах (АЧТВ, ПВ). Этот феномен впервые был описан у пациентов с системной красной волчанкой и по­этому получил название волчаночного антикоагу­лянта. Клинически, однако, при антифосфолипид­ном синдроме и волчаночном антикоагулянте нет геморрагических проявлений, но есть выраженная тенденция к патологически усиленному тромбооб-разованию. Нельзя ставить знак равенства между

волчаночным антикоагулянтом и антифосфоли-пидным синдромом. В некоторых случаях при ко-агулологических признаках волчаночного антико­агулянта не находят иммунологических признаков антифосфолипидного синдрома, в свою очередь антифосфолипидный синдром не всегда сопровож­дается коагулологическими признаками волчаноч­ного антикоагулянта.

Антифосфолипидный синдром, сопровождаю­щийся волчаночным антикоагулянтом, выявляют комбинацией фосфолипид-зависимых коагуляци-онных и иммунохимических методов, причем на­дежная диагностика обеспечивается только комп­лексным использованием группы тестов. Как пра­вило, волчаночныи антикоагулянт распознается по удлинению фосфолипид-зависимых коагуляцион-ных тестов. Волчаночныи антикоагулянт являет­ся неспецифическим ингибитором. При подозре­нии на волчаночныи антикоагулянт необходимо начинать лабораторные анализы со екрининговых тестов и теста смешивания. В табл. 29 представле­ны данные екрининговых тестов при врожденном дефиците факторов VIII и IX, при наличии специ­фического ингибитора и волчаночном антикоагу­лянте. Важно помнить, что не все реактивы для проведения АЧТВ одинаково чувствительны к волчаночному антикоагулянту. Для анализа АЧТВ при подозрении на волчаночныи антикоагулянт необходимо применять реактивы, содержащие ка­олин, но не эллаговую кислоту.

Выявление волчаночных антикоагулянтов проводят последовательно: сначала в екринин­говых методах, а затем в подтверждающих. На рис. 120 представлен алгоритм выявления вол-

Таблица 29

Изменения екрининговых тестов при врожденном дефиците факторов VIII и IX, наличии специфического ингибитора и волчаночном антикоагулянте

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Рис. 120. Алгоритм выявления волчаночных антикоагулянтов

чаночного антикоагулянта (Баркаган З.С., Мо-мот А.П., 1999).

Еще одним подтверждающим тестом для опре­деления волчаночного антикоагулянта является тест разведения. В серии последовательных разведений анализируемой плазмы буфером активность фак­торов свертывания крови, определяемая коагуля-ционным методом, относительно возрастает при наличии волчаночного антикоагулянта (табл. 30).

Таблица 30

Эффект разведения на активность факторов

свертывания в присутствии волчаночного

антикоагулянта

Для подтверждения диагноза волчаночного ан­тикоагулянта необходимо провести подтверждаю-

щие тесты, например тест нейтрализации на тром­боцитах. Проводится определение АЧТВ и активно­сти факторов внутреннего пути плазмы больного до и после инкубации с тромбоцитами здорового до­нора или эритрофосфатидом. При наличии волча­ночного антикоагулянта АЧТВ сокращается, а ак­тивность факторов возрастает за счет связывания части антифосфолипидных антител на тромбоцитах здорового человека. В группу подтверждающих вне­сены также индексы, основанные на сравнении ре­зультатов фосфолипид-зависимьгх и фосфолипид-не-зависимых тестов (лебетокс/эхитоксовый индекс).

Для уточнения диагноза антифосфолипидно-го синдрома необходимо провести определение кардиолипиновых антител с использованием ме­тода ELISA. В табл. 31 представлен перечень ан­тифосфолипидных антител, которые выявляют­ся ИФА и коагуляционным методом.

Определение антифосфолипидных антител (АФА)

АФА, выявляемые твердофазным ИФА, пред­ставляют собой различные комбинации иммуно-

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Таблица 31

Спектр антифосфолипидных антител, присутствующих в сыворотке больных А ФС

глобулинов, принадлежащих к классам IgG и IgM, реже IgA. Определяют аутоантитела против кардиолипина, фосфатидилсерина, β₂-гликопро-теина I. Специфичность диагностики по антите­лам различна: антитела против β₂-гликопротеи-на I демонстрируют большую специфичность, чем антитела к кардиолипину или другим фосфоли-пидам. Лабораторный диагноз антифосфолипид-ного синдрома можно ставить только в том слу­чае, если содержание диагностических аутоанти-тел в сыворотке крови, выявленных иммунофер-ментным методом, подтверждает патологию по­вторно с интервалом, по крайней мере, в 6 недель.

Результаты определения АФА могут считаться положительными лишь при их повышении в 2 и более раза по сравнению с верхней границей нор­мы. Кроме того, необходимо иметь в виду, что АФА присутствуют всегда в сыворотке здоровых людей, но они заблокированы гистонами и их титр достаточно низкий.

Определению АФА может мешать ревмато­идный фактор, поэтому, если на фоне клиничес­ких признаков заболевания иммунохимические тесты на АФА дают отрицательный результат, то необходимо провести коагулянтные тесты на на­личие волчаночного антикоагулянта.

Тесты аля исслелования фибринолитической системы

■

.■.. ■ ■

Основным функциональным ферментом фиб-ринолиза является плазмин. При лизисе фибрино-вого сгустка плазминоген и его активаторы фик­сируются на фибрине, где идет активное расщеп­ление субстрата, тогда как в плазме фибринолиз слабо выражен, плазмин блокирован а₂-антиплаз-мином.

Спонтанный эуглобулиновый лизис

Спонтанный эуглобулиновый лизис - тради­ционный метод оценки фибринолиза. В кислой среде при низкой температуре происходит осаж­дение эуглобулиновой фракции белков плазмы, содержащей фибриноген, факторы свертывания, плазминоген и его активаторы (рис. 121). Ингиби­торы фибринолиза выпадают в осадок в незначи­тельном количестве (около 2%). После растворе­ния эуглобулиновой фракции и образования фиб-

ринового сгустка определяют время его лизиса, что отражает фибринолитическую активность плазмы. Укорочение времени лизиса эуглобулинов (ак­тивация фибринолиза) отмечается при:

• уменьшении концентрации фибриногена -
гипо- и дисфибриногенемия;

• увеличении содержания плазминогена и его ак­
тиваторов - панкреатит, панкреонекроз, мета-

Рис. 121. Компоненты фибринолитической системы, ко­торые определяют результаты метода «спонтанный эугло­булиновый лизис»

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

стазирующии рак предстательной железы, лег­кого, яичников, метастазы меланомы, операции на легких, предстательной, поджелудочной же­лезе, гиперкатехоламинемия (стресс, тиреоток­сикоз, гипертонический криз, введение адрена­лина), шок, патология беременности, терми­нальные и другие состояния, сопровождающи­еся развитием ДВС-синдрома, цирроз, рак, ме­тастатическое поражение печени (снижение ан-типлазминовой и антиактиваторной функции). Увеличение времени лизиса эуглобулинов (угне­тение фибринолиза) отмечается при:

• гиперфибриногенемии;

• врожденной а-, гипо- или дисплазминогенемии;

• дефиците плазминогена и его активаторов - ре­
цидивирующие венозные тромбозы, системные
васкулиты, сепсис, нефротический синдром, ги-
покоагуляционная стадия ДВС-синдрома, цир­
роз печени (нарушение синтеза плазминогена).
Тест может применяться при фибринолитичес-

кой терапии для контроля эффективности лечения. Метод требует учета исходного содержания в плазме фибриногена, так как при снижении фиб­риногена время лизиса укорачивается, что трак­туется ошибочно как гиперфибринолиз. При ги­перфибриногенемии время лизиса удлиняется. Поэтому при отклонениях содержания фибрино­гена в плазме, а также неполноценной полимери­зации фибрина и гепаринемии возможно получе­ние ошибочных результатов. В связи с ориентиро­вочным характером и недостаточной специфично­стью в последнее время вместо теста спонтанного лизиса эуглобулинового сгустка начали использо­вать определение отдельных факторов фибрино­лиза, в первую очередь плазминогена.

Определение плазминогена

Дефицит плазминогена - один из потенциаль­ных факторов риска тромбоза, хотя клинически это подтверждается не всегда.

При добавлении стрептокиназы (бактериаль­ный препарат, который используется как тромбо-литик) к разведенному образцу исследуемой плаз­мы образуется плазминоген-стрептокиназный ком­плекс, который обладает ферментативной актив­ностью и способен расщеплять хромогенный суб­страт (рис. 122). Ферментативная активность ком­плекса плазминоген-стрептокиназа не подавляет­ся α₂-макроглобулином и α₂-антиплазмином. Тес­ты, в которых сначала переводили плазминоген в плазмин, а затем пытались определить активность плазмина, не получились надежными, так как сво­бодный плазмин мгновенно инактивируется α₂-ан-типлазмином, присутствующим в пробе.

Определение α₂ -антиплазмина

α₂ -антиплазмин - самый быстрый «реактив­ный» ингибитор плазмина, он не позволяет при­сутствовать плазмину в крови в свободном виде. α₂ -антиплазмин, помимо плазмина, ингибирует активаторы плазминогена - урокиназу (u-РА) и тка­невой активатор (t-PA). Дефицит α₂-антиплазмина встречается относительно редко, но если возникает, то это сопровождается тяжелым геморрагическим синдромом, проявляющимся диапедезными крово­течениями. Основной причиной кровотечений яв­ляется присутствие свободного плазмина, который разрушает все тромбы и деградирует фибриноген.

Определение α₂-антиплазмина вместе с опре­делением ингибитора тканевого активатора плаз­миногена типа 1 (PAI-1), XIII фактора можно рас­сматривать как тесты 2-го уровня, которые необ­ходимо выполнять, если скрининговые тесты (ПВ, АЧТВ, ТВ и определение функции тромбоцитов) нормальны, а больной страдает кровотечениями.

Уменьшение содержания (активности) α₂ -ан-типлазмина наблюдается при:

• врожденном (наследственном) дефиците;

• заболеваниях печени (нарушается синтез α₂-ан-
типлазмина);

Рис. 122. Принцип определения плазминогена хромогенным методом. СК - стрептокиназа

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

• ДВС-синдроме;

• лейкозах;

• нефротическом синдроме;

• интенсивной тромболитической терапии, ко­
торая может вызвать потребление α₂-анти-
плазмина.

После экстракорпорального кровообраще­ния с использованием АИК может наблюдаться истощение α₂-антиплазмина, что приводит к ги-перфибринолизу, сочетающемуся с истощением фибриногена, деградацией плазмином плазмен­ных белков (в том числе факторов гемостаза), разрушением тромбоцитов и кровотечениями.

Принцип определения α₂-антиплазмина подо­бен технологиям определения других ингибито­ров (рис. 123). Так как происходит быстрая инак­тивация плазмина α₂-антиплазмином, то стадия ингибирования и стадия измерения стартуют практически одновременно (что позволяет повы­сить специфичность метода при сниженной актив­ности ингибитора в плазме).