Метод определения гексоз, связанных с серомукоидом

Серомукоиды – это особый вид гликопротеидов, которые растворимы в хлорной кислоте, но нерастворимы в фосфорновольфрамовой кислоте. Для их определения остальные белки осаждают хлорной кислотой, добавляя к надосадочной жидкости фосфорновольфрамомую кислоту, осаждают серомукоиды, осадок отмывают, растворяют в щелочи и определяют содержание гексоз по реакции с орцином. Количество гексоз характеризует общее содержание серомукоидов.

Самые разнообразные воспалительные процессы приводят к увеличению содержания связанных с белками или серомукоидом сыворотки гексоз. Наибольшее диагностическое значение имеет их определение для выявления вялотекущих воспалительных процессов, повышение этих показателей свидетельствует об активации процесса, даже если клинические симптомы еще не проявились. Чаще всего связанные с белками гексозы исследуют ревматологи.

Реактивы:

1. Орциновый реактив. Готовят смешиванием двух реактивов: А – серная кислота и Б – раствор орцина, 16 г/л. Реактив А готовят, осторожно добавляя к 40 мл воды 60 мл концентрированной серной кислоты. Реактив Б готовят, растворяя 1,6 г орцина в 100 мл воды. Перед определением смешивают 7,5 мл реактива А и 1 мл реактива Б.

2. 96%-ный этиловый спирт.

3. Натр едкий, 0,1 Н раствор.

4. Хлорная кислота, 0,6 моль/л, содержит 6% HCIО₄.

5. Фосфорновольфрамовая кислота, 50г/л. Готовят растворяя 5 г ее в 100 мл 2Н HCI.

6. Калибровочный раствор, содержащий 45 мг галактозы и 45 мг маннозы в 100 мл воды.

Ход определения:

К 1 мл сыворотки или плазмы добавляют 1 мл воды и после перемешивания осторожно приливают 2 мл 0,6 Н хлорной кислоты, перемешивают и оставляют стоять на 10 минут, после чего центрифугируют при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в чистую пробирку, добавляют 2 мл 5%-ного раствора фосфорновольфрамовой кислоты, перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют 2 мл 96 %-ного спирта, снова перемешивают и центрифугируют 10 мин при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют, осадок растворяют в 1 мл 0,1 Н NaOH, приливают 8,5 мл орцинового реактива. Дальнейшее определение проводят так же, как определение общего количества связанных с белками гексоз.

Построение калибровочного графика. 0,05-0,5 мл калибровочного раствора доводят водой до объема 1 мл и приливают 8,5 мл орцинового реактива; дальнейшее определение проводят так же, как и в опыте. Окраска раствора, в которой взято 0,5 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию гексоз, связанных с серомукоидом, - 2,5 ммоль/л. Окраска раствора, в который взято 0,4 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию в сыворотке 2 ммоль/л связанных с серомукоидом гексоз и т.д.

Общее количество гексоз, связанных с белками сыворотки или плазмы, составляет в норме 5,8-6,6 ммоль/л, из них с серомукоидом связано 1,2-1,6 ммоль/л.