Э. Активация полимерных носителей

Активация г ядро к сильных и аминогрупп носителя. Под акти­вацией матрицы понимают проведение химической реакции с активатором, в результате которой на ее поверхности образу­ются электрофильные группы, обладающие высокой реакцион­ной способностью по отношению к нуклеофнльным группам на белке (например, аммно- и SH-группам). В числе наиболее эффективных электроф ильных групп можно назвать следующие (Дж. Порат, 1976):

имндокарбонйты

карбонаты

эпоксиды — СН—CHs

аэирндииы —СН—СНа

\ / NH

активированные двойные связи, напри- CHs=^CH—

мер —.О^СН— С (О)—

активированные атомы галогена, на- Вг—CHsr—С (О)—
гример Cl—G=NH

Реакции взаимодействия электрофилышх групп носителя с нуклеофильными группами белка будут рассмотрены в гл. III. Здесь остановимся на способах получения самих активиро­ванных полимерных матриц.

Имидокарбонаты. Получение этих производных основано иа реакции полимеров с циан галогена ми. Взаимодействие BrCN н водной или смешанной водно-органической среде с двумя сосед­ними гндроксильными группами носителя приводит к образова­нию через неустойчивый цизнат активного имидокарбоната (I) и неактивного карбамата (II):

н& (HI II

Как правило, этот прием используется для активации полисаха­ридов. Синтетические полимеры активируют этим способом зна­чительно реже.

При температуре ^20°С оптимальное значение рН этой реакции 11,0—12,5. Реакция в этих условиях крайне нерацио­нальна. Дело в том, что создание сильно щелочной среды обусловлено необходимостью повышения нуклеофильности носи­теля, например полисахарида (за счет частичной ионизации ОН-группы). Однако здесь неустойчив как сам BrCN, так и образующийся эфир, который гидролизуется с образованием неактивного карбамата. Поэтому более 80% эфира циамата трансформируется по пути (II). Эффективность этой реакции можно повысить, увеличив электрофнльность циановой группи­ровки. Такая возможность была реализована путем промежуточ­ного переноса этой группировки на триэтнламин:

Ы(Е1)з + BrCN----- *~ N5SSC—N* <Е1)_Э ВГ

@—ОН + NSaO-N* (El)jBr------ т- (Й)—О—O=3N

Реакция активации идет при рН 7—8 через образование очень реакционноспособного комплекса триэтиламмонийннтрнла (более реакционноспособного, чем BrCN), который атакует неиокизо-ванные ОН-группы полисахарида. При снижении рН с 12 до 7 в 20 раз снижается расход BrCN, вместо 4 включается до 24% от внесенного азота (причем 98% оказывается в составе актив­ных групп матрицы вместо 10% по старой методике). Эффек­тивность включения повышается до 50%, а токсичность снижа­ется практически до нуля, если вместо BrCN использовать 1-циан-4-диметиламинопнридинтетрафторборат.

Эпоксиды (оксираны). Например, 1,4-бис (2,3-эпоксипро-покси)бутан часто используют для модификации и активации гидрокс ил содержат их полимеров;

,—СН— C

ОН + СН,—СН—СНг—О—{СН_г)₄—О—СН,

СН_аСН—СН_а—О—(СН*)₄—О—СНг—СН—СН,

Реакция протекает в щелочной среде (рН 8,5—11,0), реакцион­ная способность образующегося эфнра в отношении нуклеофиль-

иых групп белков проявляется в обычном порядке: SH;> NH₂ ;> ОН. Попутно может протекать реакция сшивки матрицы:

<Н>—О—СН,—-сн—-р

В результате матрица становится нерастворимой в кипящей воде и более устойчивой к кислотам.

Для получения эпоксиактнвированной матрицы вместо бис* оксирана можно употреблять эпихлоргндрин. Преимущество носителей, эпоксидированных длинноцепочечными соединениями типа диглицилового эфира 1,4-«-бутандиола, по сравнению с носи­телями, обработанными эпихлоргидрином, и в целом преиму­щества метода эпоксидирования перед другими, в частности, бромцнановым, заключаются в том, что он дает возможность получать длинную «иожку», отделяющую фермент от носителя. Это обстоятельство может иметь значение для уменьшения потери ферментативной активности из-за стерических затруднений, возни­кающих в процессе иммобилизации.

Соединения с активированными двойными связями- В поли­меры, содержащие гидроксильиые или аминогруппы, можно ввес­ти винилсульфонильные группы. Для этого матрицу обрабаты­вают дивннилсульфоном в сильнощелочной среде:

-CHj—СНа—SO₃—CH=CH,

Этот метод активации используется редко ввиду токсичности днвинилсульфона.

Весьма аффективными агентами для активации полисахари­дов оказались ароматические хиноны, в частности бензохинон:

О

Реакция протекает легко с высоким выходом, в широком интер­вале рН (от 3 до 10).

Соединения с активным атомом галогена, Хлортриазины (на пример, цианурхлорид) легко реагирует с гидроксильной и ами ногруппой полимера в щелочной водно-орган и чес кой среде:

(где R = ^CJ; —NH₂; —NHR')

Наиболее часто этим способом активируют полисахариды и их аминопроизводные, хотя используются и белковые носители (коллаген, кератин_т фиброин). Среди синтетических полимеров амннированный полистирол и поливиниловый спирт также могут быть успешно активированы хлортрназинами.

Эффектнвным реагентом, позволяющим проводить реакцию в мягких условиях (рН 7,5) _t является трезилклорид (трифтор-этил сульфон ил хлорид):

:Н₃ОН *■ С1—SOj—CHa—

I,—О— Юг —СН_Д—CF₃ + НС1

Альдегидные группы. Введение реакцноннослособных альде­гидных групп может быть осуществлено несколькими путями. Полимеры, имеющие гидрокскльные группы, например полисаха­риды, могут быть окислены под действием периодата натрия. В качестве примера можно привести структуру эвена диалъде-гидцел л юл оэ ы:

п

Применение альдегидных производных полисахаридов часто обе­спечивает меньшую потерю активности фермента, чем, например, хлортриазильных производных.

Введение альдегидных групп в полимеры, содержащие амино­группы, можно проводить с помощью диальдегидов, например глутарового альдегида. Таким способом можно активировать аминоэтилцеллюлозу, амннополистнрол, ПААГ, полиамиды, бел­ковые носители и т, д. Реакцию активации аминогрупп можно представить так:

-NH_a + НОС—(CHi)_s—CHO

_N=CH—(ГИ_а)₃—СНО

И наконец, введение альдегидной группы можно осуществить при полимеризации, подбирая соответствующий мономер, на­пример аддукты полиакролеина и гидросульфита натрия, сопо­лимеры ненасыщенных альдегидов и вин ил пиррол ид она и т. д. Один из процессов разобран выше (получение ваиакрила).

Имидоэфирные группы ( —C = NH—). Введение этих групп

I OR

применяется как один из способов активации полиамидных но­сителей. Схему реакции с диметилсульфатом можно представить следующим образом:

.10

—С—NH----- 1£У&^ — C=NH—

I 1

О ОСНэ

Полимерные нитрилы обработкой хлор водородом в среде ме­танола также можно активировать до имидопроизводных:

—Н_гС—СН

I

EN

net.

I

C=NH

I OCR,

Диазогруппы ( —N^NCI). Их введение—весьма широко применяемый способ активации носителей, содержащих амино­группы в ароматических радикалах. В качестве примера можно назвать л-аминобензилцел.пюлозу, поли -rt-аминости рол, наиболее часто активируемые этим путем. К амннопроиэводным также от­носятся ароматические амннолронзводные шелка, шерсти, хи­тина, частично гидролизе ванный полиамид и др.

Довольно сложная схема активации сефарозы с целью вве­дения peaкционнеспособных диазогрупл предложена С. Икедой и С. Фукуи (1973):

®—nhccjw.

Аминогруппы, Введение этих групп (с последующим диазотнро-ванием) в носители, содержащие ОН-группы, может осуществ­ляться различными способами. Полисахариды, как правило» об­рабатывают хлоран гидридом л-нитробензойнон кислоты, далее NOs-rpynnu восстанавливают до NHs-rpynn:

ОН-группы поливинилового спирта активируют взанмодейст-»м с 2-(ж-ами|юфенил)-!,3~диоксоланом (а) или я-нитрофе нилхлорметаиом (б):

кн.

IK]

)Н

Активация карбоксильных групп носителя. Введение азидной группы — это один из наиболее старых способов активации но­сителей. Чаще всего для этой цели используют карбоксильные производные полисахаридов — целлюлозы, декстрана. Модифи цированный препарат этернфицнруют, переводят в гидразид, а затем в азид:

H,CONHNHj

_С)Н|Ш

В качестве источника для получения азида можно применять и полимеры, не имеющие карбоксильных групп. Например, поли-акриламид, обработанный гидразином («энзакрил АН»), легко превращается в азид непосредственно перед иммобилизацией фермента:

@— CONHj -™'™U. @—CONHNH,------------- *- @—CONj

В последнее время азидный метод применяется редко из-за одно­временного протекания ряда побочных реакций, приводящих к образованию неактивных амидных и карбамндных групп на носи­теле.

Широкое распространение получил метод ацклирования в присутствии карбодиимидов. В качестве карбоксилсодержащих полимеров могут быть использованы производные полисахари­дов, различные полимеры на основе акриловой кислоты, сополи­меры N-винил пи рролидона и ненасыщенных кислот и др.:

г*

(н)—соон+с

П—R

И наконец, весьма эффективным методом активации носите­лей, содержащих карбоксильные группы, является ацилирова-ние, в присутствии реактива Вудворда (1Ч-этил-5-фенилоксазо-лий-З'-сульфоната):

_м

Этот процесс характеризуется такими положительными качест­вами, как быстрота, мягкие условия протекания и, что очень важно, возможностью легко контролировать количество введен­ных активированных групп.

Модификация амидных групп (на примере полнакриламида). Как правило, первая стадия активации полимера, содержащего амидную группу, -^ это проведение реакции переамндирования:

f ° ЖШт

I ⁴NH_a I JO

Не—cr

Образовавшаяся функциональная группа требует дополни­тельного активирования. Оно может быть проведено различны­ми путями. Один из них — формирование стабильного диокси-производного с последующим окислением до альдегида непосред­ственно перед взаимодействием с ферментом:

t. Щ,-" СН—СГ

И— (CHiV-^NHi ^х *^шш* ⁴NH—(СНа)!— NHCHjCH

ОМ

(к)

^XNH—(CHj)^ NHCBj

Другой путь последующей активации полнакриламида — это введение дназогруппы:

'-^Wlh ш (g)—CONHfCH,)*—NHCO—QH<-NOi-^—

(H)—COWH(CHt)_t—NHCO—CfitU—

---- *- (g)—CONH<CH2>₄—NHCO—C«H*—H^SNCl

Модификация бензольного ядрй (иа примере полистирола). Наиболее распространенными из реакций модификации поли-стирплы1ых матриц являются хлорметилирование и нитрование. Хлорметилирование может быть проведено различными способа-ми^ например под действием монохлордиметилового эфира в присутствии SnCU:

I I

Хлорметильное производное может быть промодифицировано дальше избытком амина по отношению к хлорметильным груп­пам (для предотвращения сшивания полистирольных цепей):

HsNHR

1

НаС НС

Nal

I

HsC НС

(R =—<CH₃)₂NH_a: —(CH₄»_aNH(CH*)₂NH₂)

Схема процесса нитрования с последующим восстановлени ем нитрогруппы может быть представлена так:

HsC H_aC НаС

Н,с

N=N(C|)

Кроме этих* наиболее известных способов модификации бен­зольного ядра полимера используют также методы, основанные на введении альдегидных к карбоксильных групп:

СО(СН»),СООН