Путем включения в гель

Содержание фермента в геле. Каталитическая активность им­мобилизованного препарата возрастает с увеличением количества включенного фермента. Такого увеличения можно добиться, оче­видно, повышая концентрацию фермента а исходной смеси, ис­пользуемой дли приготовления геля. Следует, однако, иметь в виду, что растворимость белков в гелеобразующих системах может быть существенно ниже растворимости в водном буферном раст­воре.

Другой важный фактор, определяющий содержание фермента в геле,, — это структура самого геля, точнее^ размер имеющихся в нем пор. Чем меньше диаметр пор, тем более эффективно фер­мент удерживается в матрице геля, а значит, тем выше будет каталитическая активность иммобилизованного препарата. Порис­тость геля можно регулировать, изменяя состав исходной смеси для его получения. Например, плотность гелей, получаемых поли­меризацией производных акриловой кислоты, возрастает с увели­чением исходной концентрации мономера. (Следует помнить, од­нако, что слишком высокая концентрация мономера может вызы­вать денатурацию фермента, поэтому зависимость удельной ка­талитической активности иммобилизованного препарата от исход­ной концентрации мономера часто проходит через максимум, который обычно лежит в интервале концентраций мономера 30—60%.) Размер пор сильно зависит также от концентрации добавляемого в раствор мономера сшивающего агента, В случае акриловых полимеров эта зависимость имеет вид кривой с миниму­мом при концентрации сшивки около 5%. При этой же концентра­ции сшивки достигается максимальная активность включенного фермента.

Эффективность включения повышается не только при умень­шении диаметра пор геля, но и при увеличении размеров фермент­ной глобулы. Поэтому для предотвращения вымывания из геля ферменты с небольшой молекулярной массой иногда перед прове­дением иммобилизации подвергают обработке глутаровым альде­гидом, в результате которой получаются крупные ковалентно сшитые белковые агрегаты, прочно удерживаемые полимерной матрицей.

размеры геле вы х частиц. Увеличение концентрации фермента в геле* не всегда приводит к соответствующему повышению ката­литической активности иммобилизованного препарата. Дело в том, что при высокой концентрации фермента весь субстрат перера­батывается уже в поверхностном слое геле вой частицы, не дости­гая молекул фермента, расположенных в ее глубине. В результате каталитический потенциал системы используется не полностью и общая наблюдаемая удельная активность фермента снижается. (Более подробное обсуждение этого вопроса см, в гл. IV.) Оче­видно, что влияние этого неблагоприятного эффекта можно осла­бить, если использовать мелкоизмельченный препарат иммоби­лизованного в геле фермента. Действительно, скорость реакции, катализируемой 0-галактозидазой, иммобилизованной в геле поли-оксйэтилметакрилата, возрастает при измельчении геля и дости­гает максимального значения при уменьшении диаметра гелееых частиц до 120 мкм, оставаясь затем неизменной. Рассмотрим некоторые способы получения иммобилизованных в геле фермен­тов в форме мелких частиц.

Наиболее простой метод заключается в механическом измель­чении блока полимерного геля путем растирания, продавливання через мелкое сито, а также гомогенизации (рис. 8,а). Этот метод»